赭曲霉毒素 赭曲霉毒素A快速检测办法研究进展及其在中药中的使用远景
胡淑荣+应光耀+胡玉莉+杨世海+杨美华
[摘要] 赭曲霉毒素A（OTA）是一类首要由曲霉属和青霉属等真菌发作的次级代谢产品，具有激烈的肾毒性，致畸、致癌、致骤变等效果。研讨标明OTA不只广泛污染于食物饲料和农作物中，近年来在香辛料、甘草等中草药中也被证明广泛存在。鉴于OTA的普遍性和损害性，該文别离总述了可视化试纸条、流式微球技能、电化学传感器、外表增强拉曼光谱等技能在OTA快速检测上的运用，预期为完成OTA检测快速化、操作简略化、仪器小型化的高通量检测研讨和运用供给参阅。
[关键词] 赭曲霉毒素A；中药；快速检测办法
[Abstract] Ochratoxin A （OTA） is a toxic secondary metabolite mainly produced by Aspergillus and Penicillium species，with strong renal toxicity，teratogenic，carcinogenic，mutagenic effect. Studies have shown that OTA is not only widely contaminated in food and feed crops，but also has been widely contaminated in Chinese herbal medicines such as spices，licorice and so on. In view of OTA′s universality and harmfulness，this paper summarizes the flow visualization test strip，microsphere，electrochemical sensor，surface enhanced Raman spectroscopy technology in OTA rapid detection，which provides reference for the research and application of high throughout detection instrument miniaturization in order to achieve OTA quick detection and simple operation.
[Key words] ochratoxin A；Chinese medicine；rapid detection method
跟着中药材出口逐年添加，我国中药材的安全问题也遭到了全国际的广泛重视。中药材安全问题除了其本身的内源性毒素，例如川乌中的乌头碱、雷公藤中的雷公藤碱等外，真菌毒素、农药、重金属这3大首要外源性污染物也严重要挟着中药材的安全性和质量。因为中药材本身营养成分丰厚和外部环境的影响，在栽培、采收、加工、运送和贮藏进程中操作不妥极易污染真菌，进而发作各种真菌毒素[1]。
真菌毒素是由真菌发作的次级代谢产品，种类繁复，包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素、玉米赤霉烯酮等，其间赭曲霉毒素A（OTA）是由二氢异香豆素以酰胺键结合1个苯丙氨酸构成的苯基氨酰衍生物，是赭曲霉毒素系列中毒性最强的真菌毒素，在二氢异香豆素环上的氯原子能够增强毒性，脱氯的赭曲霉毒素B（OTB）其毒性要比OTA小10倍。OTA首要由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉发作，不只具有致癌、致畸和致骤变效果，还具有肝肾毒性、免疫毒性等，并且化学性质安稳，只要在250 ℃以上温度加热数分钟才干下降OTA的浓度，已被国际癌症研讨中心（IARC）界说为Ⅱ类致癌物质，这严重影响了中药的质量和效果，对人类健康构成极大要挟，也阻止其进出口贸易和中药国际化和现代化进程，如欧盟规则辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黄及其混合物中OTA的定量为15 μg·kg-1，甘草根的浸渍物中OTA 定量为20 μg·kg-1，我国台湾对婴儿食物中OTA的定量规范为不得检出[2-6]。
1 中药中赭曲霉毒素污染现状
中药大多来源于自然界中的植物和动物，而产赭曲霉毒素A的霉菌在自然界中具有广泛性。因而，中药也简略遭到这些霉菌的损害。近年来跟着中药在疾病防备与医治、保健品、食物开发等方面重要性的进步，中药中真菌毒素的污染也备受重视。为了保证中药、保健品和食物等安全及人体健康，国际各国及相关安排十分重视真菌毒素的检测及其污染的操控。我国中药材种类繁复，资源丰厚，就药典录入的种类就有2 000余种，栽培和加工技能有很大的不同，成分基质杂乱。近几年文献报导，OTA污染首要会集在根及根茎类、种子果实类和芳香植物中等[7-12]，见表1。
2 依据抗体的快速检测办法
依据抗体的快速检测是以抗体抗原免疫化学反响为根底，对抗体抗原含量进行测定的一种办法，具有高度的特异性、活络度和快速简洁等长处。OTA相对分子质量为403.82，归于半抗原，抗原性较弱，在免疫反响中，只具有反响原性而不具有免疫原性，因而只要与蛋白质等大分子物质结合后，才具有免疫原性[13]。
2.1 胶体金免疫色谱技能 胶体金免疫色谱技能（gold immunochromatography assay，GICA）是1种将单克隆抗体技能、胶体金符号技能和免疫检测技能等多种办法有机结合在一起的固相符号免疫检测技能。OTA快速检测验纸条运用了竞赛按捺免疫层析的办法，从加样处开端别离为样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸。对金标垫用处理液进行处理然后喷上金标抗体进行偶联，NC膜的检测线（T线）为偶联了BSA的OTA和操控线（C线）为羊抗鼠的二抗。
赖卫华等[14]运用竞赛按捺免疫层析的办法，研制出了1种用于快速检测赭曲霉毒素A的胶体金试纸条，其检测限为10 μg·L-1，检测时刻为10 min。该试验的成果研讨标明，赭曲霉毒素A的结构相似物赭曲霉毒素B，桔霉素与赭曲霉毒素A快速检测验纸条不发作穿插反响，标明赭曲霉毒素A快速检测验纸条具有较好的特异性。现在该办法因为具有快速、操作简略、检测时刻短等特色，可用于大批次样品的检测，其在食物和中药中的检测会得到充沛发展和宽广运用。
2.2 流式微球技能 流式微球技能是将荧光编码微球与流式细胞仪相结合的新式技能，该技能能够完成高通量一起剖析样品中的多种待测方针，现在已广泛运用于食物、农产品和环境等范畴的快速检测，尤其是小分子物质包括农药和真菌毒素的高通量多方针的快速检测[15-18]。
肖昌彬等[19]运用流式微球技能检测中药麦芽中的OTA含量，其将荧光编码微球与牛血清白蛋白-OTA（BSA-OTA）偶联构成微球-蛋白包被抗原偶联物，将简略前处理后的麦芽样品参加到复合物溶液后，使样品中的OTA与微球-蛋白包被抗原偶联物一起竞赛OTA特异性辨认的生物素润饰单克隆抗体，参加荧光探针（异硫氰酸荧光素符号羊抗小鼠二抗，FITC-IgG）孵育1 h后，选用流式细胞仪检测微球外表的均匀荧光强度，然后完成麦芽中OTA的定性和定量检测。该办法检出限能到达0.12 μg·L-1，基质搅扰小，加样回收率在93.9%～97.4%，RSD小于3.6%，且线性杰出，R20.989 2。16批实践麦芽样品中，检测到2个阳性样品，最高量3.83 μg·kg-1，且与LC-MS-MS的确证成果共同。该技能与其他剖析办法比较照，每次检测所需试剂少，样品消耗量低，因而检测本钱也较低[20]，关于中药材中赭曲霉毒素A或其他同类真菌毒素的快速检测具有巨大远景。
2.3 电阻抗免疫传感器技能 生物传感器技能是由多学科范畴穿插的产品，当运用该技能进行物质检测时，待测物经扩散效果进入生物活性材猜中，经过与辨认元件或感受器（如：酶、抗体、适配体等）发作生物化学反响并发作改变，运用物理和化学转换器（如：氧电极、光敏管等）和电子扩大器将该改变转化成可定量处理的声、光、电等信号，经过一系列规范曲线，就能够精确丈量出待测物质的浓度[21]。尽管光学剖析办法的研讨比较照较抢手，可是因为电化学剖析办法不受样品色彩、弄清度等影响，只需要简略的前处理进程即可完成对方针物质的剖析检测，并且所需的仪器设备简略，如电化学作业站，因其价格低廉、操作简略、检测设备简便易带着、检测快速且活络度高、易于微型化和集成化的特性，国内外环境作业者将其广泛运用于水体中重金属的检测傍边[22-23]。
依据检测信号类型不同，电化学免疫传感器可分为电流型、电位型、电导型和阻抗型。因为生物体和生物反响的电特性，例如抗体和抗原发作反响后会引起电极间介质的阻抗发作改变，然后经过丈量阻抗改变值来完成对方针剖析物的检测。Francesca等[24]开发了用于定量测定赭曲霉毒素A（OTA）的一次性丝网印刷碳电极（SPCE）上的阻抗符号免疫传感器。在用金纳米颗粒（AuNP）润饰SPCE外表后，经过半胱胺层将抗-OTA固定在作业电极上。在每個涂覆进程之后，经过循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）表征改性外表。挑选电容作为在不同OTA浓度下电极外表的电性质的可再现的改变的最佳参数，并且其用于研讨所开发的免疫传感器的剖析参数。在优化条件下免疫传感器之间的线性关系为0.3～20 μg·L-1，检测下限为0.25 μg·L-1，合适许多常见食物中的OTA含量检测。该办法一起用于丈量红葡萄酒样品中的OTA，并将成果与用竞赛性ELISA试剂盒成果进行比较。成果显现免疫传感器对低于2 μg·kg-1的OTA较活络，契合欧洲法规中对常见产品食物所树立的OTA定量规范。
因为免疫的快速检测办法大大都是依据免疫竞赛的原理，因而所需的抗体数量大，现在大都抗体挑选和制备技能多是在生理条件下进行，从小鼠到家兔，乃至是羊驼和骆驼等大型动物都被用于免疫和制备相应的抗体，因而该技能最大的难点就是制备时刻长、费用高、具有不安稳性。此外抗体本身化学性质不安稳，简略受温度、pH等影响，发作不可逆的变性，并且与结构相似物的穿插反响较多，受杂乱基质如中药材等的搅扰大，简略呈现假阳性的成果，活络度也受所制备的抗体的亲和力约束，这些缺乏之处均影响了以抗体为根底的检测技能和办法的推行和运用[25-27]，见表2。
3 依据适配体的快速检测办法
核酸适配体是经指数富集的配体体系进化（SELEX）技能在体外化学组成并经过层层挑选得到的单链寡核苷酸片段，一般由数10个核苷酸组成，能够是RNA或许单链DNA[28]。适配体可结合物质规模广泛，不只能够和酶、蛋白质等大分子结合，也能与氨基酸、激素、真菌毒素、农药，乃至是重金属元素等生物或化学小分子发作高特异性、高亲和力的结合[29]。其高亲和力结合首要在于适配体能与各种靶物质经过分子间效果力构成愈加安稳的三维空间结构且与靶分子结合空间位阻小，因而安稳性好，不易遭到环境中的核酸酶、酸碱性物质和有机试剂的影响[30]。Cruz-Aguado和Penner[31]初次挑选出OTA的核酸适配体，不只为食物、粮食和饲猜中OTA的剖析检测带来便当，也为中药材快速检测OTA起到了衬托效果。
3.1 胶体金适配体试纸条技能 胶体金适配体试纸条技能原理与胶体金免疫试纸条相似，均由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、测验线（T线）、质控线（C线）、PVC底板和吸水垫组成，结构见图1。在结合垫上，3′-端经巯基润饰的OTA适配体与胶体金经过Au-S键合构成安稳的金标探针，T线上包括一段与OTA适配体互补的核酸片段，并用生物素进行润饰，C线上包括一段含胸腺嘧啶的核酸片段，用生物素进行润饰，能与OTA适配体结合。傍边药样品溶液滴在样品垫中后，因为毛细管效果，样品溶液沿着试纸条活动，假使样品中存在OTA，OTA将与结合垫中的金标探针结合，依据竞赛法的原理，T线则不显色，而C线显色，若样品中无OTA，则T线和C线均显色。
Zhou等[32]选用依据适配体技能的胶体金试纸条运用于中药黄芪中OTA的检测发现，胶体金特征、巨细、胶体金-适配体结合物的数量、搬迁速率和甲醇的量都会影响试纸条的检测活络度。终究优化后发现，将胶体金-适配体结合物浓度稀释4倍后终究呈现出显着的色彩改变，经过调理运转缓冲液成分和份额、膜类型和关闭缓冲液的成分和份额，然后优化出最佳搬迁速率，在缩短检测时刻的一起也进步了检测活络度。此外，还发现甲醇浓度超越20%后会影响金标探针的开释直接导致显色效果。研制的胶体金适配体测流试纸条检测OTA的检测限为1 μg·L-1，检测用时为15 min，且与同类毒素无穿插反响。当检测9个黄芪样品时发现有1个阳性样品，成果与液质联用的办法共同。尽管试纸条上的色彩深浅与OTA的含量成反比，且检测耗时少，但仍是1种半定量的办法，假使在胶体金材猜中引进荧光物质，或将发光资料以夹心法的办法与胶体金和适配体衔接，结合能够读取荧光强度的设备，就能够精确快速定量中药材中OTA的含量，进行现场快筛。
3.2 电化学适配体传感器技能 在适配体技能的根底上，为了满意杂乱样品如食物、饲料和中药材中痕量方针物如农药、真菌毒素等检测需求，就要寻找到进步检测活络度的信号扩大办法。因为金属纳米粒子含有许多的金属离子，并且能够经过电化学的办法检测出来，依据这一特性能够将金属纳米粒子作为扩大检测信号的信号分子，挑选具有杰出生物亲和性纳米资料作为基底或母体（如SiO2纳米粒子等），将多个活化后的另一种纳米资料（如CdS量子点、磁微球等）装载在经润饰后的基底上构成复合型纳米资料，然后与sDNA反响后构成纳米信号探针，将cDNA与金电极自拼装构成捕获探针，将两者相结合构成电化学生物传感器，运用免疫竞赛原理和电化学作业站进行检测，就能够定性定量检测超低含量的方针物，如食物、粮食和中药材中的赭曲霉毒素A[33-35]。
在生物传感器的范畴中，因为纳米资料的介入，凭借其在光学、电学、磁学和化学活性等性能上的共同表现，使本身就依据纳米等级分子运作的生物传感器能够更好的在小分子化合物检测上如虎添翼[36]。Bonel等[37]将OTA特异性的适配体与磁微球反响孵化成功用化的磁球，运用磁场的磁力将润饰过的磁微球固定于丝网印刷电极上，辣根过氧化物酶-OTA结合物与供试溶液中游离的OTA发作竞赛反响，反响的产品选用差示脉冲伏安法来测定，该办法在检测OTA上线性规模广，在0.78～8.74 μg·L-1，且检测限能到达0.007 μg·L-1，在实践样品小麦中检测OTA含量，其成果的RSD小于8%，专特色强，与同类毒素也不发作穿插反响。
3.3 外表增强拉曼光谱技能 外表增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）技能是依据拉曼散射效应，将待测分子吸附在某些经特殊化润饰、具有纳米结构特性的金属外表上，然后增强其拉曼散射效应的分子振荡光谱技能[38]。该技能不只能供给待测分子的具体结构信息，并且对待测物的检测限理论上能到达单分子的水平，比惯例的拉曼技能的活络度高出数个数量级，然后能完成对痕量物质，尤其是中药材中的真菌毒素（如赭曲霉毒素A等）的快速定量检测。为了削减杂乱的基质效应，SERS的运用首要是将贵金属纳米粒（如纳米金颗粒、纳米银颗粒等）与信标寡核苷酸单链相结合，将该结合物作为SERS的信号增强基底，然后完成食物等基质中有害小分子物质和真菌毒素的高活络检测[39-42]。
Ganbold等[43]用Cy5荧光染料符号OTA适配体，并吸附于纳米银颗粒外表，增强了拉曼光谱信号，当环境体系中存在OTA时，就会与适配体结合发作结构改变，并使原先Cy5-OTA与纳米银颗粒之间的化学键开裂，然后使拉曼光谱的信号强度下降。在浓度0.1～10 nmol·L-1，跟着OTA浓度的上升，拉曼光谱的信号强度能够下降到40%。此外他们还选用杀鼠灵作为对照组来验证该办法的抗搅扰才能，成果证明杀鼠灵不会搅扰外表增强拉曼光谱的信号及强度。该办法的检测限极低，能到达0.1 nmol·L-1的水平，只需要很少的样品量和极短的检测时刻（30 s）就可测得OTA的含量，因而，这在中药材中OTA的现场实时快速检测具有很大的运用远景。
此外，外表增强拉曼光谱技能为中医药成分的判定供给了一种更为精确、客观、直接的判定手法。李宁等[44]将外表拉曼光谱技能与其他检测手法和数据处理办法结合后成功辨别出了单味中医药的成分、产地以及真伪，在中医药煎剂成分的判定中也表现出了其优越性。外表增强拉曼光谱技能作为一种新的判定手法，在中医药判定方面有着巨大的潜力，有望成为中医药判定的另一强壮东西，见表3。
4 其他快速检测办法
近红外光谱成像（near-infrared hyperspectral imaging）是一种现代光谱技能，是将现代电子技能、光谱剖析技能、计算机技能和化学计量学技能彼此结合的集合体[45]。近红外光谱成像是近年来发展起来的一种新的剖析手法，特别是在剖析化学成分和污染物的空间散布测定方面，近红外图画技能具有完成快速、无损、原位、在线剖析的特色。经过近红外图画不光能够得到生物安排和化学成分的明晰概括和散布信息，并且还能够经过化学计量学办法完成对特定方针成分的定性和定量剖析[46]。
Senthilkumar T等[47]运用近红外（NIR）高光谱成像体系对贮存的小麦中的白曲霉、青霉属感染和赭曲霉毒素A污染進行检测研讨。每两周对真菌感染的样品进行成像，将从图画数据取得的三维超立方体转换成二维数据。将主成分剖析运用于二维数据并依据最高因子载荷，1 280，1 300，1 350 nm被辨认为有用波长。提取对应于有用波长的6个计算特征和10个直方图特征，运用二次和马氏判别分类器对其进行线性测定。成果显现一切3个分类器从健康内核别离真菌感染的内核分类精确度大于90%。二次判别分类器为成对，双向和六路分类模型供给了比线性和马氏分类器更高的分类精度。赭曲霉毒素A污染的样品除了对应于真菌感染的2个有用波长之外，在1 480 nm具有共同的明显波长，仅在赭曲霉毒素A污染的样品中判定在1 480 nm的峰。赭曲霉毒素A污染的样品能够运用NIR高光谱成像体系以100%分类精度检测。 NIR高光谱体系能够区别不同真菌感染阶段和贮存小麦中不同水平的赭曲霉毒素A污染。
近红外光谱技能以其速度快、操作简略、功率高、无污染和本钱低一级特色，已被广泛运用于各个范畴，它不光能剖析与含氢基团直接相关的有机物，并且在无机物的检测上也有许多成功实例，可是其效果机理有待进一步研讨。跟着近红外光谱硬件设备本钱的不断下降，进一步完善软件的数理计算办法，进步从杂乱、堆叠和改变的红外光谱中提取有用信息的功率，添加光谱的信噪比，将其运用于中药中赭曲霉毒素A的检测的远景将愈加宽广。
5 总结与展望
近些年，跟着色谱技能和液相-质谱联用技能的不断晋级和推行，有关中药材中真菌毒素，尤其是赭曲霉毒素A污染的报导逐年添加。液相及其质谱联用技能尽管比较曩昔的薄层色谱等技能在检测时刻上缩短了，可是因为其杂乱的前处理进程，仪器无法随身带着等缺点，无法完成实时快速的现场检测。以抗体-抗原免疫反响和适配体为根底的OTA快速检测技能能够添补这个技能空缺。本文总述了可视化试纸条、流式微球技能、电化学传感器、外表增强拉曼光谱技能等可完成仪器小型化、检测快速化、操作简略化的OTA检测办法，一起这些办法充沛显现了快速检测在检测速度、活络度、检测限上的优势。可是这些快速检测办法或多或少存在着一些缺点和缺乏，例如依据抗体的免疫法快速检测，抗体的本身不安稳性和繁琐的制备办法阻止了该办法的运用普及性和精确性，以及高生物亲和力的纳米资料的制备工艺还未老练，然后添加了新式快速检测技能的运用本钱。所以在未来，高亲和力、安稳性好的抗体体外快速制备技能是处理和推动中药材中OTA快速检测技能妨碍的有用途径之一。依据适配体的快速检测办法中功用化磁球等纳米资料的造价较贵重，跟着工业化推动和制备工艺的改进，运用其超低的检测限和超强的去基质搅扰才能，有望替代现在抗体制备杂乱且费时的免疫检测办法，若将这一形式转移到中药材中真菌毒素（如赭曲霉毒素A）的现场快速检测上，可望完成中药材中真菌毒素实时高通量的快速检测。
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[責任修改 丁广治]