铁皮石斛专卖 铁皮石斛促成长内生真菌的挑选与判定
侯晓强+郭顺星
[摘要]石斛生境中存在多种可以促进石斛成长的内生真菌，使用内生真菌与铁皮石斛组培苗共生培育，挑选对铁皮石斛组培苗有促成长活性的内生真菌，研讨内生真菌对石斛根的侵染状况，选用形状判定和分子判定的办法对促成长活性内生真菌进行判定。成果标明，8株内生真菌对铁皮石斛苗有促成长效果，均能侵染铁皮石斛根，在铁皮石斛根的根被、外皮层、皮层中以菌丝或菌丝团的方式存在，不侵染内皮层和中柱，差异于有害真菌。8株活性内生真菌中，2株产孢真菌经形状判定，归于Pestalotiopsis，Eurotium属，6株不产孢真菌经分子判定，别离归于Pyrenochaeta，Coprinellus，Pholiota，Alternaria，Helotiales等5个属。促成长活性内生真菌与石斛组培苗共生培育，可促进石斛组培苗成长，关于缩短石斛成长周期，添加石斛中药材资源具有指导意义。
[关键词]铁皮石斛；内生真菌；促成长活性；侵染检测；菌种判定
铁皮石斛Dendrobium officinale是常用贵重中药材，具有利胃生津、滋阴清热等成效。因为石斛的天然繁衍率低，对环境条件要求较严厉，产区药农长时间采挖，天然资源已濒临灭绝。尽管石斛安排培育体系已成功树立，可很多繁衍石斛组培苗，但组培苗移栽成活率低，成长缓慢，成为石斛组培苗人工培育的瓶颈。兰科植物与真菌可以构成典型共生联系，内生真菌或菌根真菌对兰科植物种子萌生、成长、成苗具有重要的促进效果。相同生境下的不同兰科植物有着相似的菌根真菌，而不同生境的同一兰科植物有不同的菌根真菌，两者间的共生联系对错专一性的[1]。范黎等[2]发现不同的真菌可促进同一种兰科植物的种子萌生，同一真菌也可与一种以上的兰科植物的种子构成共生联系。郭顺星等[3]别离的2株内生真菌对铁皮石斛苗有促成长的活性。吴慧凤等[4]也取得了9株对铁皮石斛有促成长效果的内生真菌。本实验评论石斛属植物的内生真菌对铁皮石斛苗的效果，以期取得对石斛苗有促成长活性的内生真菌，为人工培育石斛和组培苗移栽成活供给新的技能手段和理论基础。
1 资料
植物资料为铁皮石斛组培苗。内生真菌为别离自石斛属植物的36株内生真菌，由我国医学科学院药用植物研讨所真菌室保存。
PDA培育基：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂12 g，水1 L；组培培育基：1/2MS（很多成分折半），马铃薯200 g，蔗糖30 g，活性炭2 g ，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8；共生培育基：1/2MS（很多成分折半），蔗糖 7.5 g，琼脂 7.5 g，水1 L，pH 5.8。
2 办法
2.1 内生真菌的培育
内生真菌接种于PDA培育基上，25 ℃漆黑培育10 d。
2.2 铁皮石斛组培苗的培育
将铁皮石斛组培苗继代于组培培育基上，在培育温度（昼/夜）25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培育，至铁皮石斛苗长到4～6叶期。
2.3 共生培育
取4～6叶期、成长共同的铁皮石斛组培苗接种至含有50 mL共生培育基的三角瓶中，每瓶接种1株，将1片直径6 mm菌片接种在距苗1 cm处，对照接种1片直径6 mm的PDA培育基。置于培育温度（昼/夜）25 ℃/18 ℃、光照周期12/12 h、光强2 000 lx的条件下培育45 d。
2.4 促进铁皮石斛苗成长的内生真菌的挑选
共生培育完毕后，依据植株形状目标衡量内生真菌的效果，去掉病苗、死苗，计算成活苗的株高、茎粗、分蘖、生根等的形状目标挑选出有促成长活性的内生真菌。
2.5 内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测
共生的铁皮石斛苗根系以流水冲刷洁净，切成0.5 cm小段，FAA溶液固定，白腊包埋，切片，番红固绿对染，加拿大树胶封片，光学显微镜下调查。
2.6 促成长活性内生真菌的判定
2.6.1 形状判定 对产孢内生真菌的培育特性、显微形状特征进行调查，依据萨卡图（Saccardo）和休斯-塔巴基-巴伦（Hughes-Tabaki-Barron）真菌分类体系进行判定，分类检索参照文献[5-7]。
2.6.2 分子判定 对不产孢内生真菌依据rDNA 的内部转录距离区（ITS）序列进行分子判定。内生真菌DNA提取选用CTAB法[8]，用通用引物ITS1：（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′），ITS4：（ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） [9]扩增ITS 1，5.8S和ITS2的全序列。PCR反响体系50 μL：1×PCR buffer，MgCl2 3 mmol·L-1，4种dNTP各200 mmol·L-1，上下游引物各0.3 μmol·L-1，Taq酶2.0 U，DNA模板2 μL。反响程序：94 ℃预变性3 min，进入循环，94 ℃变性1 min，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，72 ℃延伸8 min。PCR产品送上海生工测序。将不同真菌的ITS序列在GenBank中进行BLAST剖析，寻觅与查询序列相似性大于95%[10]的rDNA ITS序列，使用ClustalX 1.83软件进行全序列比对[11]，用Paup* 4b10软件[12]进行聚类剖析，构建最大邻接树。依据聚类成果，对内生真菌进行分子判定。
3 成果与剖析
3.1 促进铁皮石斛成长的内生真菌endprint
内生真菌与铁皮石斛共生培育后，有8个菌株具有促成长效果，其他28个菌株对铁皮石斛苗致病或致死，见图1。
铁皮石斛接菌苗的各个成长目标数据见表1，8个有促成长活性的菌株，对铁皮石斛苗的鲜重、茎粗、新根数量、最长根长度，新芽数量等均有不同程度的正向影响，而在株高、干重和最长芽长度3个方面没有显着影响。单因素方差剖析标明，与对照比较，8个菌株均可以添加铁皮石斛苗的鲜重，其间05-R-5和34-S-9对铁皮石斛苗鲜重的影响达显着水平；别离比对照进步了84.4%，112.0%。8个菌株对铁皮石斛苗干重也有促进效果，但未到达显着水平。在茎直径方面，G03-R-5，05-R-5，22-R-4，38-S-11，34-S-9的促进效果都到达显着水平，别离比对照添加85.8%，85.8%，85.8%，143.3%，114.6%。在石斛苗新根数量上，G03-R-5，G08-R-17没有正向影响，别的6个菌株体现出了促进效果，其间22-R-4显着添加了石斛苗新根的数量，比对照高出120.1%。在最长根的长度方面，每个菌株也都有促进效果，05-R-5，38-S-11的促进效果显着，别离比对照添加107.8%，92.3%。对苗新芽数量的影响，22-R-4与对照水平适当，其他7个菌株具有促进效果，G03-R-5，35-R-11达显着水平，均比对照高150.0%。8个菌株对苗新芽成长的效果不显着，没有到达显着水平。
每一株真菌的接种，对铁皮石斛苗不同的成长目标的影响不同。G03-R-5对铁皮石斛苗的8个成长目标均有正向影响，对茎直径和新芽数量的影响达显着水平。35-R-11首要促进铁皮石斛苗的新芽数量；05-R-05首要促进铁皮石斛苗鲜重、茎直径和最长根的长度；22-R-4首要影响铁皮石斛苗的茎直径和新根的数量，具有促进生根的效果；38-S-11显着进步铁皮石斛苗的茎直径和最长根的长度；34-S-9首要进步铁皮石斛苗的鲜重和茎直径，G08-R-17显着进步铁皮石斛苗的新芽数量，具有促分蘖的效果。40-R-3对铁皮石斛苗除株高和最长芽长度外的6个成长目标均有促进效果，但并未到达显着水平。由此可见，单株真菌可以从不同的方面促进石斛苗的成长，关于铁皮石斛苗的每个成长目标，不同的菌株也体现出不同的促进效果。
3.2 内生真菌对铁皮石斛苗侵染的检测
内生真菌与铁皮石斛共培育后，白腊切片剖析8个促成长活性内生真菌和2个（19-R-18，38-R-18）有害真菌对铁皮石斛根的侵染状况。接菌铁皮石斛苗的根系都被真菌菌丝包被，根表无根毛细胞。解剖调查标明，内生真菌均能侵入铁皮石斛苗的根被安排，并在根被细胞中扩展或定殖。不同真菌在各安排中存在方式不同，见表2。
在根被安排中，菌株22-R-4，G03-R-5构成了菌丝团，G08-R-17构成了菌丝圈，05-R-5，19-R-18，35-R-11，38-S-11，38-R-18，40-R-3以菌丝穿行于根被细胞之间，其间19-R-18和38-R-18可以构成细胞膨大的菌丝，而34-S-9则以分生孢子的方式存在。菌丝在进入根被细胞时，根被细胞并没有体现出任何防护的反响，见图2。
在外皮层，尤其是外皮层通道细胞中，真菌形状首要是菌丝和菌丝团。22-R-4，38-S-11，G08-R-17在外皮层通道细胞内环绕细胞核构成菌丝团结构。05-R-5，19-R-18，38-R-18是以菌丝的方式存在。34-S-9，35-R-11，40-R-3 和G03-R-5并没有侵染通道细胞。19-R-18的菌丝挨近外皮层及侵染外皮层通道细胞时，外皮层细胞和通道细胞发生了细胞壁木质化加厚反响，来反抗真菌的侵略。G03-R-5在外皮层外侧根被细胞定殖，外皮层细胞也发生了防护反响，见图2。
在皮层细胞中，菌株G08-R-17，22-R-4构成了菌丝团结构，菌株05-R-5的菌丝在皮层细胞中穿行，其他活性真菌接种的铁皮石斛苗根的皮层细胞中，没有调查到菌丝存在，皮层细胞没有体现出任何的不良反响，见表1，图2。而19-R-18在根被中定植时，皮层靠外侧的细胞发生了防护反响，其细胞壁木质化加厚。共生实验中，菌株38-R-18不利于植株成长，其菌丝可在皮层细胞中扩展，并进入木质部导管和韧皮部筛管中定植，这可能是对宿主构成损伤的原因，见图2。
3.3 促成长活性内生真菌的判定
3.3.1 产孢内生真菌的判定 依据产孢内生真菌的培育特性、显微形状特征，依据萨卡图（Saccardo）和休斯-塔巴基-巴伦（Hughes-Tabaki-Barron）真菌分类体系进行判定。
菌株34-S-9特征：在PDA或麦麸糖培育基上，菌落白色，气生菌丝较兴旺，黑色孢子堆散布其间，边际规整，反面淡黄色。菌丝无色，直径2.0～4.0 μm，有隔阂。分生孢子椭圆形至纺锤形，具4个横膈，两头细胞无色，锥形，中心细胞黑色，15.0～19.0×4.5～6.0 μm。据此特征判定为Pestalotiopsis sp.
菌株40-R-3特征：在PDA或麦麸糖培育基上，菌落棕色，气生菌丝不兴旺，贴培育基成长，边际不规整，反面棕色，培育基内有很多色素存在，呈棕色。菌丝棕色，有隔阂，菌丝外表不光滑，直径5.0～10.0 μm。分生孢子梗瓶梗状，多个聚生在一同，8.0～12.0×5.0～8.0 μm，多个分生孢子串生在分生孢子梗上。分生孢子棕色，单胞，双层壁，外表有纹饰，巨细8.0～15.0×5.0～10.0 μm，孢子具有基细胞。据此特征判定为Eurotium repens de Bary。
3.3.2 不产孢内生真菌的判定 对各菌株及与其ITS序列相似性大于95%的已知真菌进行Blast剖析，构建最大邻接树，取得与待测菌株聚在同一分支且相似性最大的已知真菌，见表3。依据相似性大于等于99%，可以判定到种，相似性在95%～99%，可以判定到属，而相似形小于95%，只能判定到科的序列相似性准则[13]，菌株22-R-4，35-R-11别离与匹配序列归于同一个种，别离为Coprinellus angulatus和Pholiota multicingulata；菌株05-R-05，38-S-11尽管可以判定到种，但匹配菌株只判定到属，因此菌株05-R-05，38-S-11也只能判定到属，别离为Pyrenochaeta sp.，Alternaria sp.；菌株G03-R-5，G08-R-17别离与匹配序列归于同一个属，别离为Pyrenochaeta sp.，Helotiales sp.。endprint
4 评论
别离自石斛属植物的36个内生真菌与铁皮石斛共生培育，取得了8个对铁皮石斛苗有促成长活性的菌株，不同菌株对苗的促成长效果体现在不同的成长目标上，其促成长效果强度亦存在显着的差异。吴慧凤等[4]在对铁皮石斛促成长内生真菌挑选中也得到了相似的成果。菌根真菌和兰科宿主植物之间的专一性并不非常严厉，但某种菌根真菌同哪种兰科植物更能有效地共生也有显着的倾向[14]。8株内生真菌中22-R-4，G08-R-17的菌丝可以侵入皮层，并构成兰科植物典型菌根结构——菌丝团，是铁皮石斛的菌根真菌。菌根真菌可以促进兰科植物种子的萌生、植株的成长、矿质元素的吸收、植物化学成分的堆集等[15]。其他6株内生真菌没有与铁皮石斛根构成典型的菌根结构，但也具有促成长效果，可能是内生真菌发生了某些可以促进兰科植物成长的次生代谢物。张集慧等[16]发现兰科植物内生真菌小菇属真菌Mycena sp. 菌丝或发酵液中含赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米素核苷等5 种植物激素。吴静萍等[17]从密花石斛内生真菌镰孢菌属Fusarium sp. 菌丝抽提物中别离得到赤霉素，可显着进步植株生物量、含氮量和含磷量。具有促成长活性的8株内生真菌归于7个不同的属，其间4个属Pestalotiopsis[18]，Pyrenochaeta[19]，Alternaria[20]，Helotiales[21]的内生真菌，有学者亦从石斛属植物中别离得到。由此可见，石斛的生境中存在多种可以促进石斛成长的内生真菌，它们在石斛成长过程中扮演着重要人物。取得这些真菌并使用内生真菌共生技能，大力推广应用于铁皮石斛的培育，进步组培石斛麦苗出瓶成苗率，缩短石斛的成长周期，关于添加石斛中药材资源具有重要意义。
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Screening and identification of endophytic fungi with growth promoting
effect on Dendrobium officinale
HOU Xiao-qiang1，2， GUO Shun-xing1*
（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；
2. College of Life Science， Langfang Normal University， Langfang 065000， China）
[Abstract] The endophytic fungi with plant growth promoting effects were screened by co-culture of each endophytic fungus and seedlings of Dendrobium officinale. Anatomical features of the inoculated roots were studied by paraffin sectioning. Morphological characteristics and rDNA ITS1-5.8S-ITS2 sequences were applied for the taxonomy of endophytic fungi. The results showed that 8 strains inoculated to D. officinale seedlings greatly enhanced plant height， stem diameter， new roots number and biomass. According to the anatomical features of the inoculated roots， each fungus could infect the velamina of seedlings. The hyphae or pelotons were existed in the exodermis passage cells and cortex cells. The effective fungi could not infect the endodermis and vascular bundle sheath， but which was exception for other fungi with harmful to seedlings. Combined with classic morphologic classification， 2 effective strains were identified which were subjected to Pestalotiopsis and Eurotium. Six species of fungi without conidiophore belonged to Pyrenochaeta， Coprinellus， Pholiota， Alternaria， Helotiales， which were identified by sequencing the PCR-amplified rDNA ITS1-5.8S-ITS2 regions. The co-culture technology of effective endophytic fungi and plant can apply to cultivate the seedlings of D. officinale. It is feasible to shorten growth cycle of D. officinale and increase the resource of Chinese herbs.
[Key words]Dendrobium officinale； endophytic fungus； growth promoting activity； anatomical features； taxonomy
doi：10.4268/cjcmm20141705endprint