微生物极限方法学验证 乌芪舒筋通络片微生物极限查看方法学研讨

陈震尧+谢锴标+姚伟生

[摘要]意图 树立乌芪舒筋通络片的微生物极限查看办法。办法 根据《我国药典》2015年版第四部“1105、1106、1107”对乌芪舒筋通络片进行微生物极限查看办法学研讨。成果 需氧菌总数选用平皿稀释法和薄膜过滤法、霉菌和酵母菌总数选用平皿惯例法，收回率均在0.5～2，操控菌选用直接接种法能够查看出大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌。定论 需氧菌总数选取平皿稀释法、霉菌和酵母菌总数选取平皿惯例法、操控菌选取直接接种法检测，办法可行，操作更简洁，适用于乌芪舒筋通络片的微生物极限查看。

[关键词]乌芪舒筋通络片；微生物极限；办法学研讨；《我国药典》2015年版

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107.jpg" >

[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition

烏芪舒筋通络片是根据我院省名中医验方制成的纯中药制剂，具有补肝肾，通络止痛的效果，由细辛、制川乌、制草乌、桂枝、牛大力、防己、黑山君、蜈蚣、走马胎、羚羊角骨、牛膝、黄芪、杜仲、续断、甘草等药味组成[1]。该制剂微生物极限查看法原按《我国药典》2010年版进行办法学验证[2]，跟着《我国药典》2015年版的施行，新版微生物极限查看办法改变很大，有必要从头进行验证。为此，本研讨按《我国药典》2015 年版四部“1105、1106、1107”项下办法[3]，对该制剂的微生物极限查看办法进行了再次验证研讨，制订了新的切实可行的微生物极限查看法，替代了旧规范，并使用于该制剂的日常查验，使该制剂的微生物极限查看法提升到新版《我国药典》的水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SZX型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（姑苏净化设备有限公司）；YXQWF32-500卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；LRH-250A生化培育箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培育箱（上海跃进医疗器械厂）；CX31生物显微镜（奥林巴斯）；HTY HOMO761匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；JA2003N电子天平（上海精细科学仪器有限公司）；JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司协作出品）。

1.2 样品

乌芪舒筋通络片（肇庆市中医院，批号：15050401；15051102；15052401）。

1.3 菌种

试验所用的菌株传代次数不得超越5代[4]，并选用适合的保藏办法保存，保证试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌种均来自于我国食品药品检定研讨院。

1.4 培育基

胰酪大豆胨琼脂培育基（批号：3105210）、沙氏葡萄糖琼脂培育基（批号：3105120）、胰酪大豆胨液体培育基（批号：3105305）、沙氏葡萄糖液体培育基（批号：3105054）、麦康凯液体培育基（批号：3105291）、麦康凯琼脂培育基（批号：3105138）、RV沙门增菌液体培育基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基（批号：3104852）、三铁塘琼脂培育基（批号：3105052）、肠道菌增菌液体培育基（批号：3105093）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培育基（批号：3104750），均由广东环凯微生物科技有限公司出产，运用前先进行培育基的适用性查看，并且在有用期内运用，培育基的制备依照标明办法进行。

1.5稀释液、冲刷液

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3105256）、胰酪大豆胨液体培育基（批号：3105305）、0.9%无菌氯化钠溶液（克己）。

2 办法与成果

参照《我国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物极限查看法[3]进行验证。

2.1 菌液制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培育物别离接种至100 ml胰酪大豆胨液体培育基中，30～35℃培育18～24 h；别离取各培育物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递加稀释级数制成每毫升含菌数为<100 cfu 的菌悬液[4]。

2.1.2 白色念珠菌

取白色念珠菌的新鲜培育物接种至100 ml沙氏葡萄糖液体培育基中，20～25℃培育2～3 d，取培育物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递加稀释级数制备成每毫升含菌数<100 cfu 的菌悬液[4]。

2.1.3黑曲霉

取黑曲霉新鲜培育物接种至沙氏葡萄糖琼脂培育基中，20～25℃培育5～7 d，参加3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子。再选用适合的办法将孢子悬液吸至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每毫升含菌数<100 cfu 的孢子悬液[4]。

2.2 供试液的制备

取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培育基至100 ml，用匀浆仪打碎，混匀，作为1∶10的供试液。量取1∶10的供试液10 ml，加胰酪大豆胨液体培育基稀释至100 ml，混匀，作1∶100的供试液。

2.3 微生物计数办法适用性试验

2.3.1 平皿惯例法

2.3.1.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶10的供试液5份，每份100 ml，分別参加金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，马上倾泻胰酪大豆胨琼脂培育基，凝结，30～35℃中培育≤3 d，计数。

霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10的供试液2份，每份100 ml，别离参加白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，马上倾泻沙氏葡萄糖琼脂培育基，凝结，20～25℃中培育≤5 d，计数。

2.3.1.2 供试品对照组 取1∶10的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌液，同试验组操作。

2.3.1.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培育基替代1∶10的供试液，按试验组项下办法操作，参加试验菌液并进行微生物收回试验。

2.3.1.4 核算 各菌株的收回率（R）=（试验组的均匀菌落数-供试品对照组的均匀菌落数）/菌液组的均匀菌落数×100%[5-6]，根据《我国药典》2015年版四部规则，比值R应为0.5≤R≤2[7-9]（表1）。

2.3.2 平皿稀释法

2.3.2.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶100的供试液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”项下办法操作。

霉菌和酵母菌总数计数：选用平皿惯例法R为0.5～2，所以不再进行稀释法研讨。

2.3.2.2 供试品对照组 取1∶100的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌液同试验组操作。

2.3.2.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培育基替代1∶100的供试液，按试验组项下操作办法参加试验菌液并进行微生物收回试验。

2.3.2.4 核算 按“2.3.1.4”项下公式核算，成果见表2。

2.3.3 薄膜过滤法

2.3.3.1试验组 取1∶10供试液10 ml，滤过，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，分2次冲刷滤膜，在第2次冲刷中参加相应的菌液适量（含菌量≤100 cfu），滤过，取出滤膜，需氧菌查看将膜贴于胰酪大豆胨琼脂培育基中，在30～35℃下培育，≤3 d，霉菌和酵母菌查看将膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培育基中，在20～25℃下培育≤3 d。

2.3.3.2 供试品对照组 取1∶10供试液10 ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌液同试验组操作。

2.3.3.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培育基替代1∶10的供试液，按试验组项下操作办法参加试验菌液，一起进行微生物收回试验。

2.3.3.4 核算 按“2.3.1.4”项下公式核算，成果见表3。

由表1～3可知，乌芪舒筋通络片需氧菌总数计数查看选用平皿稀释法、薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数查看选用平皿惯例法、薄膜过滤法，R均在0.5～2内，契合《我国药典》2015年版四部微生物学极限查看验证的要求。考虑到实践操作中，平皿惯例法、平皿稀释法操作简洁，优于操作繁琐的薄膜过滤法，故需氧菌总数计数法可选用培育基稀释法，霉菌和酵母菌总数计数查看选用平皿惯例法为最佳办法。

2.4 操控菌适用性试验

2.4.1耐胆盐革兰阴性菌查看验证试验

取1∶10供试液适量，混匀，20～25℃培育2 h，作为预培育供试品。取预培育供试品3份，每份10 ml，别离参加10 ml肠道菌增菌液体培育基，第1份参加1 ml缓冲液作为供试品组，第2份参加1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大肠埃希菌阳性对照组，第3份参加1 ml铜绿假单胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培育基10 ml，参加10 ml肠道菌增菌液体培育基及1 ml缓冲液，作为阴性对照组。于30～35℃培育24～48 h，划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂培育基的平板上，30～35℃下培育18～24 h，调查菌落形状，成果见表4。

2.4.2大肠埃希菌查看验证试验

取1∶10供试液2份，每份10 ml，别离参加到100 ml胰酪大豆胨液体培育基中，第1份参加1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份参加1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组；另取胰酪大豆胨液体培育基110 ml，参加1 ml缓冲液，作为阴性对照组，均于30～35℃中培育18～24 h。

取以上培育物1 ml参加到100 ml麦康凯液体培育基中，在42～44℃下培育24～48 h。然后划线接种于麦康凯琼脂平板上，在30～35℃下培育18～72 h，调查菌落形状，成果见表5。

2.4.3沙门菌查看验证试验

取1∶10供试液2份，每份100 ml，第1份参加1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份参加1 ml沙门菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培育基100 ml，参加1 ml缓冲液，作为阴性对照组，在30～35℃下培養18～24 h。然后别离取培育物0.1 ml，接种至10 ml RV沙门增菌液体培育基中，在30～35℃下培育18～24 h，取少数RV沙门增菌液体培育物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培育基上，在30～35℃下培育18～48 h，用接种针选择疑似菌落，进行斜面和高层穿刺接种于三糖铁琼脂培育基上，于30～35℃中培育18～24 h，调查菌落形状，成果见表6。

由表4～6可知，操控菌查看选用直接接种法，即可到达要求。

3评论

2015年版与2010年版《我国药典》比较[10-11]，微生物计数法适用性试验，从对细菌总数作办法适用性查看，变成对需氧菌总数作办法适用性试验，试验菌株3种变为5种；培育基由胰酪大豆胨琼脂替代养分琼脂，用于查看需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂培育基替代玫瑰红钠培育基，用于查看霉菌与酵母菌，尽管增加了试验的工作量，但却具有杰出的广谱性，进步检出率，办法更活络[12]。对操控菌的查看，新版删除了大肠菌群的查看，新增了耐胆盐革兰阴性菌的查看[13]，对含有药材粉末的固体口服给药制剂都有必要查看沙门菌，进步了对致病菌操控的要求。

乌芪舒筋通络片处方药味中多种成分含有抗菌活性[14-15]，由试验可知，对需氧菌具有抑制效果，故需氧菌总数计数查看时选用惯例平皿法收回率较低，需选用平皿稀释法或薄膜过滤法。

在实践工作中，匀浆仪打碎样品时，经常出现泡沫，往往对验证成果形成影响，待泡沫消除后再参加菌种，基本能消除由操作引起的影响。

[参考文献]

[1]陈震尧，陈金英，姚伟生，等.乌芪舒筋通络片乌头碱定量检测办法研讨[J].我国药房，2015，26（36）：5144-5146.

[2]国家药典委员会.我国药典[M].一部.北京：我国医药科技出版社，2010：附录79-88.

[3]国家药典委员会.我国药典[M].四部.北京：我国医药科技出版社，2015：140-151.

[4]刘广文，苑艳飞.养肝解毒丸微生物极限查看法的验证试验[J].我国医药科学，2016，6（13）：54-57.

[5]文玉辉，韩珍珍.11种医院制剂微生物极限查看办法验证[J].临床医药实践，2015，24（10）：763-765.

[6]柴海毅.浅析微生物计数办法的收回率[J].医药工程设计，2013，34（1）：30-31.

[7]陈志禹，夏佳，席时东.八珍丸的我国药典2015年版微生物学查看成果剖析与点评[J].药物剖析杂志，2016，36（3）：418-425.

[8]陈志禹，夏佳，席时东.八珍颗粒《我国药典》2015年版微生物极限查看法的树立及查验成果剖析[J].我国卫生查验杂志，2015，25（23）：4051-4055.

[9]陈志禹，席时东.我国药典2015年版八珍胶囊和八珍片微生物极限查看与讨论[J].我国现代使用药学，2016，33（5）：628-634.

[10]李趣嫦，江艳芳.《我国药典》2010版与2015版微生物极限查看法对四种药物检测成果的比较[J].我国药品规范，2015，16（2）：86-90.

[11]景荣先，张国林.2015年版《我国药典》微生物极限查看法洁净环境及计数培育基修订剖析讨论[J].我国卫出工业，2015，12（5）：184-185.

[12]王洪家.解毒散结颗粒《我国药典》2015年版微生物极限查看办法学验证[J].天津药学，2016，28（4）：17-19.

[13]杨晓莉，李辉，马英英，等.《我国药典》2015年版非无菌产品微生物极限查看：操控菌查看法解读与对策[J].我国药师，2016，19（4）：748-752.

[14]黄英.清热安宫丸等中成药微生物极限查看办法验证[J].我国药业，2013，22（24）：38-40.

[15]刘广桢，张冕，胡文红，等.5种洗剂类医疗机构制剂微生物极限查看办法验证[J].药学研讨，2015，34（6）：332-334.

（收稿日期：2017-05-16 本文修改：许俊琴）