金银花绿原酸含量测定 RP—HPLC测定桑叶中绿原酸的含量
郭红霞等
[摘要] 意图 树立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定桑叶中活性成分绿原酸的办法。 办法 选用Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）色谱柱；活动相为乙腈-1.0%醋酸水溶液，选用梯度洗脱，检测波长为325 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃，进样体积10 μl。 成果 绿原酸的线性规模为0.3890～7.771 ？滋g（r=0.9994），均匀回收率为98.91%。 定论 RP-HPLC检测效率高，专特色强，重复性好，可用于桑叶中绿原酸的定量测定，可作为该药材的质量操控办法之一。
[关键词] 桑叶；绿原酸；质量操控；反相高效液相色谱法
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0017-03
桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶，初露后采收，除掉杂质，晾干，具有分散风热，清肺润燥，清肝明目之成效。首要用于风热伤风，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花[1]。现代药理研讨标明桑叶具有降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等成效[2-4]。对桑叶的质量操控研讨大部分环绕中桑叶中的活性成分芦丁来进行相应的含量测定[5-6]，也有的环绕黄酮类成分进行相应质量操控研讨[7]。现在，国内外市场对桑叶的需求愈来愈大，且本课题组在前期指纹图谱研讨中发现绿原酸也是桑叶中的首要活性成分之一[8]，因而为了进一步操控桑叶质量，本研讨选用反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）对从全国搜集的桑叶药材进行绿原酸含量测定研讨，现报导如下。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；BPZ11D型电子剖析天平（Sartorius公司）；Waters2695-2996高效液相色谱体系，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器（Waters 公司）。
1.2 试剂
甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，冰乙酸（色谱纯，北京化工厂）。
1.3 对照品及样品
对照品绿原酸购于我国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号110753-200413），不同产地的桑叶药材，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授判定为桑科植物桑（Morus alba L.）的叶。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱为Kromasil-C18（4.6 mm×250 mm，5 ？滋m）；流速：1.0 ml/min；检测波长：325 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μl；活动相：乙腈（A）-1.0%醋酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序：0→20 min，9%A→18%A。依照上述色谱条件，待测成分绿原酸别离很好，无搅扰，得色谱图1。
2.2 供试品制备
取桑叶粉（80目）约1 g置50 ml三角瓶，精细称定，加甲醇20 ml，称重，超声30 min（功率250 W，频率40 kHz），取出，静置，放凉，补重，0.22 μm微孔滤膜滤过，RP-HPLC剖析。
2.3 对照品制备
精细称取绿原酸对照品适量，用甲醇溶解，定容，得到浓度为0.3890 ？滋g/？滋l的对照品溶液。
2.4 规范曲线的制作
别离精细汲取“2.3”项下的绿原酸对照品溶液1、3、5、8、10、15、20 ？滋l进样剖析，记载按上述色谱条件测定的峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样体积（？滋l）为横坐标（X），得绿原酸的线性回归方程别离为：Y=182 283X-131 274（r=0.9994，0.3890～7.771 ？滋g）。
2.5 精细度
取同一供试品溶液，按上述RP-HPLC剖析条件，接连进样6次，核算绿原酸峰面积，成果标明，峰面积RSD值<0.65%。
2.6 重现性
一份固定粉末样品，平行制备6份供试品溶液，进行RP-HPLC剖析，调查绿原酸峰面积，峰面积的RSD值<1.02%，标明办法的重现性在差错规模内。
2.7 安稳性
制备药材供试品溶液后，在室温下放置不同时刻，别离于0、1、2、4、8、12、24、48 h进行RP-HPLC剖析，以绿原酸的峰面积核算，调查样品的安稳性，首要成分的峰面积在48 h内RSD值<1.24%，标明样品至少在48 h内是安稳的。
2.8 回收率试验
取同一批已知含量的桑叶药材样品约0.5 g，精细称定，别离精细参加一定量绿原酸对照品溶液，按“2.2”项制成加样供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，核算回收率（表1）。从表1中可知，样品的均匀回收率为98.91%，RSD为0.84%，标明回收率符合要求。
表1 加样回收率试验成果（n=6）
2.9 含量测定
依照上述色谱条件，将不同产地的样品进行处理和进样，每一个相同产地及批号的样品测3份，选用外标两点法核算桑叶中绿原酸的均匀含量（表2）。从表2中可知，不同产地的桑叶药材绿原酸含量均在0.25%以上，最高的可达0.90%，提示绿原酸确实为桑叶中的一个首要成分。
表2 桑叶药材来历及其绿原酸含量的测定成果（n=3）
3 评论
本试验依据定量化合物为酚酸，在甲醇中有较好的溶解度，挑选甲醇超声，处理简单、可控；且样品呈酸性，挑选醋酸水溶液作为水相，水相中醋酸份额是经过单要素多水平试验断定最佳份额为1.0%。挑选乙腈作为有机相来剖析中药复方，柱压安稳且较低，有利于维护仪器和色谱柱。波长挑选325 nm也是根据所测化合物在该波利益吸收最大，且杂质搅扰较少。梯度挑选均一梯度改变以确保样品具有更好的重复性。
含量测定成果标明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与现在药典中收载的芦丁含量比较，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因而主张药典桑叶规范中添加绿原酸含量测定。
在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个显着的色谱峰，课题组下一步预备别离制备这些色谱峰，进行相应结构判定和富集，为下一步展开桑叶中首要成分含量测定及其活性测验奠定根底。
中药质量规范是一个体系工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，仅仅其质量规范的一个部分。其间，影响桑叶中绿原酸含量的要素许多，如产地、初加工、采收时节等，因而，只能把绿原酸作为点评桑叶质量的目标之一，应该树立更为体系、全面、表现中药特色的桑叶质量规范。
[参考文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：279.
[2] 罗存敏.桑叶提取物对小鼠血糖的影响及其有用成份测定[J].蚕业科学，2005，31（4）：418-421.
[3] 陈建国，步文磊.桑叶多糖降糖效果及其机制研讨[J].中草药，2011，42（3）：515-520.
[4] 李超，潘建明，罗新根，等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学，2012，23（2）：18-20.
[5] 雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].我国卫生查验杂志，2012，22（3）：468-469.
[6] 周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.
[7] 马合木提·买买提明，美丽班·霍加.HPCE法测新疆桑叶中黄酮类成分的研讨[J].食物研讨与开发，2012，33（6）：134-136.
[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑叶药材HPLC指纹图谱研讨[J].我国试验方剂学杂志，2013，19（10）：119-121.
[9] 李贻奎，李连达.从复方丹参制剂的紊乱看中药规范化的迫切性与必要性[J].我国中药杂志，2008，33（4）：349-354.
（收稿日期：2013-12-03 本文修改：郭静娟）
含量测定成果标明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与现在药典中收载的芦丁含量比较，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因而主张药典桑叶规范中添加绿原酸含量测定。
在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个显着的色谱峰，课题组下一步预备别离制备这些色谱峰，进行相应结构判定和富集，为下一步展开桑叶中首要成分含量测定及其活性测验奠定根底。
中药质量规范是一个体系工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，仅仅其质量规范的一个部分。其间，影响桑叶中绿原酸含量的要素许多，如产地、初加工、采收时节等，因而，只能把绿原酸作为点评桑叶质量的目标之一，应该树立更为体系、全面、表现中药特色的桑叶质量规范。
[参考文献]
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[5] 雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].我国卫生查验杂志，2012，22（3）：468-469.
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[8] 姚江雄，李春，廖端芳，等.桑叶药材HPLC指纹图谱研讨[J].我国试验方剂学杂志，2013，19（10）：119-121.
[9] 李贻奎，李连达.从复方丹参制剂的紊乱看中药规范化的迫切性与必要性[J].我国中药杂志，2008，33（4）：349-354.
（收稿日期：2013-12-03 本文修改：郭静娟）
含量测定成果标明，不同产地桑叶活性成分绿原酸含量相差较大，中部地区河南、湖南产地的桑叶绿原酸含量较高。与现在药典中收载的芦丁含量比较，桑叶中绿原酸的含量均大于芦丁，因而主张药典桑叶规范中添加绿原酸含量测定。
在此次含量测定中，发现桑叶样品还有其他几个显着的色谱峰，课题组下一步预备别离制备这些色谱峰，进行相应结构判定和富集，为下一步展开桑叶中首要成分含量测定及其活性测验奠定根底。
中药质量规范是一个体系工程[9]，本文仅对桑叶中绿原酸的含量进行了测定，仅仅其质量规范的一个部分。其间，影响桑叶中绿原酸含量的要素许多，如产地、初加工、采收时节等，因而，只能把绿原酸作为点评桑叶质量的目标之一，应该树立更为体系、全面、表现中药特色的桑叶质量规范。
[参考文献]
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[4] 李超，潘建明，罗新根，等.桑叶消渴胶囊对2型糖尿病大鼠的影响[J].海南医学，2012，23（2）：18-20.
[5] 雷霖，何健飞.高效液相色谱法测定桑叶中芦丁的含量[J].我国卫生查验杂志，2012，22（3）：468-469.
[6] 周美环，赵书楷，陈淼，等.HPLC法测定桑叶中芦丁的含量[J].辽宁中医药大学学报，2010，12（5）：228-229.
[7] 马合木提·买买提明，美丽班·霍加.HPCE法测新疆桑叶中黄酮类成分的研讨[J].食物研讨与开发，2012，33（6）：134-136.
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[9] 李贻奎，李连达.从复方丹参制剂的紊乱看中药规范化的迫切性与必要性[J].我国中药杂志，2008，33（4）：349-354.
（收稿日期：2013-12-03 本文修改：郭静娟）