25-(OH)D3 1，25—（OH）2—D3对进展性肾炎大鼠肾小管间质胶原蛋白Ⅲ表达的影响

林建明等

[摘要] 意图 评论1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎大鼠肾小管间质胶原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表达的影响。 办法 将试验动物按随机数字表法分为3组（n=7）：假手术组（对照组）、开展性肾炎组（模型组）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干涉组（医治组）。除对照组外，其他组均选用右肾切除并2次打针IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体，制备开展性肾炎大鼠模型。1，25-（OH）2-D3干涉8周后，检测各组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及电解质的改动，Masson染色调查肾安排病理改动。免疫安排化学检测肾小管间质ColⅢ的表达。 成果 与模型组比较，1，25-（OH）2-D3医治不只使大鼠24 h尿蛋白及BUN均显着下降（P<0.05），还能使ColⅢ表达显着下调（P<0.05）。肾安排病理危害显着减轻。 定论 1，25-（OH）2-D3或许经过显着下降开展性肾炎大鼠肾小管间质ColⅢ的表达，减轻肾小管间质纤维化而发挥肾脏维护效果。

[关键词] 1，25-（OH）2-D3；ColⅢ；开展性肾炎；肾小管间质纤维化；大鼠

[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0004-04

肾小管间质的细胞外基质过度堆积简单引起肾功用不全，常见于许多缓慢肾脏疾病。间质胶原，尤其是Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，一般作为肾安排基底膜的“脚手架”而遍及存在于肾脏中[1-2]。胶原及其相关分子在肾小管间质的积累即能够界说为肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）。肾小管间质纤维化的病变程度严重影响了肾功用的正常运作。推迟或阻挠肾小管间质纤维化的开展，能够防备缓慢肾脏病的发作[3]。1，25-（OH）2-D3除调理钙磷代谢外，在调理各种生物进程（如免疫调理、细胞增殖和分解、抗纤维化、削减尿蛋白）中发挥至关重要的效果[4]。可是，1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎肾小管间质纤维化的维护效果尚不彻底清楚。本研讨旨在评论1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎大鼠模型中RIF胶原蛋白Ⅲ（ColⅢ）表达的影响，并调查肾脏安排病理形状学的改动，便于进一步了解1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎大鼠RIF的或许效果途径及影响机制。

1 材料与办法

1.1 试验材料

1，25-（OH）2-D3购自美国Sigma公司，IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体购于美国Neo Markers公司，大鼠ColⅢ免疫安排化学试剂盒购于武汉BOSTER生物工程有限公司。

1.2 仪器

全自动多功用生化剖析仪（日本Hitachi公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动物模型制备及分组

雄性SD大鼠（重庆腾鑫生物技术公司供给，二级）21只，体重（131.2±10.0） g。将21只大鼠按随机数字表法分为3组（n=7）：假手术组（对照组，只做肾包膜剥离，不予肾脏切除）、开展性肾炎组（模型组）、6 ng/（100 g·d） 1，25-（OH）2-D3干涉组（医治组），选用开展性肾炎模型参照参考文献[4]，行右肾摘除术，别离于术后第1、2周予尾静脉打针IgG（OX-7）鼠抗人Thy1.1单克隆抗体1.2 mg/（kg·d），共2次。1，25-（OH）2-D3干涉组于术后予1，25-（OH）2-D3 6 ng/（100 g·d）入饮水中灌胃至8周。一切大鼠均于8周后处死，搜集24 h尿液，取大鼠心脏血并制造肾安排标本。

1.4 调查目标与办法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 处死大鼠前3 d，将大鼠放入代谢笼中搜集24 h尿液，每只搜集3次，用双缩脲法测定尿蛋白含量，求均匀尿蛋白含量。

1.4.2 血生化检测 取大鼠心脏血清，测定血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、钙、磷等。

1.4.3 肾脏安排病理学查看 肾安排以10%甲醛固定并编号，白腊包被，2 μm厚接连切片，Masson染色，光镜下调查肾脏病理改动。细胞核染黑蓝色，胶原纤维呈绿色，肌纤维、红细胞呈赤色。

1.4.4 免疫安排化学法检测 ColⅢ蛋白的表达：取2 μm厚白腊切片，惯例脱蜡至水，灭活内原性酶，热修正抗原，抗原抗体反响，DAB显色、脱水、通明、封片、显微镜调查。操作过程按试剂盒说明书进行。阳性产品呈深褐色，不加抗体为阴性对照。

1.4.5 免疫安排化学剖析 选用显微图画剖析体系（Olympus C3040-ADU）对各组染色成果进行积分光密度值（integral optical density，IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视界，每个视界代表0.13 mm2的区域面积，核算其IOD值，取均匀值。

1.5 计算学办法

所得数据选用SPSS 18.0计算软件包进行计算学剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，经方差齐性查验，再进行两独立样本均数t查验和组内的方差剖析，查验水准α=0.05。

2 成果

2.1 1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎大鼠24 h尿蛋白、肾功用的影响

术后8周，模型组24 h尿蛋白量、SCr和BUN均显着高于对照组（P<0.05）。经1，25-（OH）2-D3干涉医治后，与模型组比较，24 h尿蛋白量、BUN均显着下降（P<0.05），两组间SCr差异无计算学含义（P>0.05）。医治前后电解质钙、磷水平在医治组无显着改动（P>0.05）（表1）。

表1 3组大鼠各项检测目标的比较（x±s）

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2 1，25-（OH）2-D3对肾安排病理改动的影响

Masson染色（图1）显现，对照组肾小管间质形状根本正常；模型组见肾小管上皮细胞萎缩、掉落，肾小管管腔扩张、间质胶原纤维增厚。与对照组比较，模型组间质炎症和纤维化进行性加剧。与模型组比较，医治组肾小管上皮细胞形状康复正常，间质炎症得到改进，胶原纤维积累削减。

2.3 1，25-（OH）2-D3对开展性肾炎大鼠肾间质ColⅢ蛋白表达的影响

ColⅢ蛋白表达首要集中于肾小管上皮细胞和间质细胞的胞质，模型组肾间质ColⅢ蛋白表达较对照组显着增多（P<0.01），使用1，25-（OH）2-D3医治后，ColⅢ表达均较模型组显着削减（P<0.05）（图2）。

3 评论

肾脏纤维化是一个常见的导致肾脏功用衰竭的终末事情。因此，了解肾脏纤维化的发作、开展进程对肾脏疾病的前期干涉医治有重大含义。近年来研讨证明，一种活性维生素D3类似物——帕立骨化三醇能够减缓单侧输尿管结扎大鼠模型中间质纤维化、按捺肾小管上皮-间充质转化（EMT）[5]、改进肾脏炎症[6-7]，削减尿蛋白，按捺足细胞危害[8]。因此，本研讨调查了开展性肾炎1，25-（OH）2-D3经过按捺RIF ColⅢ的表达，发挥开展性肾炎抗纤维化的维护效果。

本研讨中，Masson染色成果显现，模型组肾小管上皮细胞萎缩、掉落，肾小管管腔扩张、间质胶原纤维增厚，与对照组比较，模型组间质炎症和纤维化进行性加剧，证明系膜增生性肾炎模型大鼠是现在调查开展性肾炎比较抱负的动物模型[9-10]。生化目标显现，模型组24 h尿蛋白含量、SCr、BUN均较对照组显着升高，标明开展性肾炎的大鼠模型造模成功。在予以1，25-（OH）2-D3干涉医治后发现，与模型组比较，24 h尿蛋白含量及BUN均下降，提示1，25-（OH）2-D3能够削减开展性肾炎大鼠模型中的尿蛋白含量、按捺肾脏纤维化，进步肾脏功用。别的，本试验还监测了血电解质钙、磷的改动，发现在给予1，25-（OH）2-D3医治前后，钙、磷无显着计算学差异，标明该1，25-（OH）2-D3的试验浓度[11]不会引起钙、磷代谢紊乱，然后搅扰试验成果的准确性。

ColⅢ是肾安排基底膜的重要组成成分，对保持基底膜的完整性发挥重要效果[12]。ColⅢ表达的过多或过少均提示肾安排基底膜的结构及完整性发作了改动。在肾安排基底膜中，肾间质基底膜占其总量的85%～90%[13]。本研讨中亦发现开展性肾炎大鼠模型肾间质安排中ColⅢ表达较对照组显着添加，而使用1，25-（OH）2-D3干涉后，ColⅢ表达显着下降，进一步提示了1，25-（OH）2-D3或许经过ColⅢ表达削减，减轻RIF的发作、开展。本课题组前期试验发现，开展性肾炎大鼠模型肾间质安排中结缔安排生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）表达添加，该因子又是公认的较强的促纤维化生长因子[14]，可促进细胞排泄细胞外基质，如ColⅢ[15]、纤连蛋白和整合素α5显着添加[16]，提示1，25-（OH）2-D3下降ColⅢ的表达或许经过按捺肾小管间质安排中CTGF的表达发挥效果。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-11-01 本文修改：林利利）

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（收稿日期：2013-11-01 本文修改：林利利）