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李晗 张鑫 鲍树森 郝强
【摘 要】 成簇的规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫体系，经过其转录产品crRNA（CRISPR RNA）及CRISPR相关蛋（CRISPR-associated，Cas），尤其是Cas9蛋白特异性按捺侵略的DNA。该体系因为其方便靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重润饰的可能性，被广泛使用于基因修改范畴。本文首要从CRISPR/Cas9体系的相关概念及原理、技能研讨开展、使用研讨进以及CRISPR/Cas9技能使用的未来开展进行论述。
【关键词】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因修改
基因修改是指对基因组或表达产品（RNA）进行针对性润饰的进程。真核生物基因组包括上亿万个碱基，很难对其进行准确的润饰。但假如能够简略有效地做到，将会极大地推进生物学基础理论、医药及生物技能等方面的研讨的开展。CRISPR/Cas9作为新一代的基因修改技能，有着其它技能无与伦比的优势。理论上，在基因组中每8bp就有一个合适 CRISPR/Cas9修改的位点。根据CRISPR/Cas体系的作用原理，研讨人员经过体外人工合成sgRNA（small-guide RNA）与Cas9蛋白的复合物，成功完成对特定基因片段的准确剪切，由此创始了一种经过构建RNA序列介导Cas蛋白辨认并编排靶基因的新式基因修改技能。因为该技能的高效性、低成本性和简易性，关于CRISPR/Cas9体系的研讨遭到各界亲近重视，而且在越来越多的研讨范畴得到使用。
1 CRISPR/Cas9技能的根本原理
CRISPR/Cas9的根本结构包括tracrRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）序列区、cas（CRISPR associated system，cas）基因序列区、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列区，3个功用区在
DNA链上呈线性摆放。CRISPR序列区含多个重复序列（R区）和间隔序列（S区），间隔序列被呈半回文结构的重復序列离隔。CRISPR序列区可编码crRNA（CRISPR RNA），故又被称为crRNA序列区。Cas基因区接近CRISPR序列区，cas基因品种有许多，其间cas9 基因编码Cas9核酸酶，该酶受crRNA引导，对DNA靶序列进行切开。CRISPR/Cas体系分为三品种型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，而在化脓链球菌中发现的CRISPE/Cas9体系归于TypeⅡ型。
CRISPR/Cas9体系在噬菌体中起到免疫作用，当噬菌体初次侵略宿主时，cas基因编码的蛋白复合物会裂解噬菌体DNA上短间隔序列，并将裂解片段整合入本身DNA的CRISPR序列5端。当同种噬菌体再次侵入时，整合了噬菌体DNA片段的CRISPR位点会转录出crRNA，在crRNA与一段tracrRNA结合成为二元复合体后，与噬菌体DNA 20nt 的长度互补配对，继而引导Cas9核酸酶切开结合位点[1]。
2 CRISPR/Cas9技能的新开展
Samuel等[2]建立了一个模块化的存储单元，使用自我靶向RNA（stgRNA）记载细胞内分子事情，然后使它能被重复的改写来生成新的序列。他们规划了一个自我靶向导游RNA（stgRNA），它能够不断地靶向、诱变编码它的DNA。在巨细胞病毒启动子和标准ATG开始密码子的下流，他们嵌入了一个骤变检测区（MDR）。这个可变区是由stgRNA位点和紧随它的改进后的u6启动子组成。MDR直接在不同阅览框的绿色荧光蛋白（GFP）和赤色荧光蛋白（RFP）基因后边，GFP和RFP被相应的不同阅览框的“2A自我割裂（切开）多肽”分隔。不同的阅览结构是否与开始密码子同框，这取决于MDR中刺进缺失的巨细。不同数量的碱基删去会发生不同的移码骤变，然后表达不同的荧光蛋白。进而记载细胞内分子事情。
在基因修改技能方面，CRISPR/Cas9体系以其简洁性、高效性已被广泛用于基因修改，但一起也存在着脱靶的现象。Feng Zhang等[3]在构成化脓性链球菌 Cas9酶的约 1400个氨基酸中，经过改动 3个氨基酸将“脱靶修改”明显削减至无法检测到的水平。该研讨小组将这种新规划的酶命名为 “增 强 型 ”化 脓 性 链 球 菌 Cas9 （SpCas9），可用于需求高水平特异性的基因组修改使用。
3 CRISPR/Cas9技能在疾病研讨中的使用
3.1 疾病模型的构建
现在，许多遗传病的研讨是经过对来自患者的iPS细胞的研讨来完成的，可是这要花费几个月的时刻，一起也遭到细胞是否能够得到和遗传布景多样性的约束。这一问题能够经过野生型细胞系的基因修改来防止。Dominik[4]等使用CRISPR/Cas9引进阿尔兹海默氏症的恣意一种遗传骤变后，发现在CRISPR/Cas9切开位点和研讨者引进受体细胞的骤变之间存在一段序列上的间隔。研讨者发现了特别的间隔联系，就能够对干细胞的基因组进行修改使细胞包括两种阿尔兹海默氏症基因中的恣意一种，随后诱导这些干细胞转化成为神经元细胞而且发生很多β淀粉样蛋白，然后模仿阿尔兹海默氏症的疾病体现。
3.2 疾病的医治
现在，病毒医治的战略相对有限，而CRISPR/Cas9体系对病毒DNA的铲除为病毒的医治供给了新的思路。Kaminski R等[5]证明使用CRISPR基因修改体系能够有效地和安全地将HIV病毒从在体外培育的人T细胞的DNA中整理掉。我国军事医学科学院放射与辐射医学院研讨所、第四军医大学西京医院、日本京都大学和华中农业大学兽医学院等处的研讨人员研讨靶向乙肝表面抗原（HBsAg）编码区的CRISPR/Cas9体系，在体外培育的肝细胞中和活的小鼠体内的作用[6]。结果表明，CRISPR/Cas9可在体内和体外按捺HBV仿制和表达，可能是医治HBV感染的一种新战略。
在遗传病防治方面，血友病B，是十分合适用于基因医治与基因修改技能的疾病。Guan Y等人[7]发现坐落人类F9基因上的骤变Y371D能够引起比Y371S更为严重的血友病。他们用靶向这一基因位点的CRISPR/Cas9体系对小鼠进行医治，结果表明，用腺病毒为载体的基因修改体系对小鼠基因纠正率较高，但有较重的肝毒性，需进一步改进。Elizabeth等[8]进行了人血液红系祖细胞的由CRISPR/Cas9介导的基因修改，使得在HBG1和HBG2基因的启动子中的一段13nt的序列发生了骤变，进而改动了天然存在的胎儿血红蛋白（HPFH）相关骤变。而经过基因修改的红系祖细胞与胎儿血红蛋白（HbF）水平的添加也足以按捺镰状红细胞贫血因为缺氧导致的红细胞形状的改动。这有可能是未来β-地中海贫血基因医治的一项战略。
CRISPR/Cas9在肿瘤医治方面的研讨的首要战略是相关基因的敲除。2015年，Brandon等[9]初次将CRISPR技能使用到了癌症相关的基因医治研讨，他们规划了一种慢病毒载体使 CRISPR 体系能够被 doxycycline 进行诱导表达，并高效地对细胞进行修改。使用这个体系，他们完成了对 癌基因MCL-1在体内和体外的敲除。试验结果表明，慢病毒 CRISPR/Cas9 体系高效地完成了体内 CRISPR/Cas9 介导的基因组修改，经过癌基因的敲除，能够作为一种潜在的新式的癌症医治计划。CRISPR/Cas9技能在体外敲除EGFR/EGFRvIII，添加了 UBXN1的表达一起削减了NF-κB的表达，最终按捺了成胶质细胞瘤（GBM）的成长。
4 开展前景展望
跟着CRISPR/Cas9技能的日益开展与完善，它在科研的基因修改范畴发挥重要作用的一起，也将会给临床医治供给一个簇新的思路，尤其是在抗DNA病毒感染和肿瘤医治方面。隨着靶向RNA的CRISPR体系的发现，也为抗RNA病毒感染供给了新的思路。
参考文献
[1].Jiang， W.， et al. Nucleic Acids Res， 2013. 41（20）： p. e188.
[2].Perli， S.D.， C.H. Cui， and T.K. Lu. Science， 2016. 353（6304）.
[3].Slaymaker， I.M.， et al. Science， 2016. 351（6268）： p. 84-8.
[4].Paquet， D.， et al. Nature， 2016. 533（7601）： p. 125-9.
[5].Kaminski， R.， et al. Sci Rep， 2016. 6： p. 22555.
[6].Zhen， S.， et al. Gene Ther， 2015. 22（5）： p. 404-12.
[7].Guan， Y.， et al. EMBO Mol Med， 2016. 8（5）： p. 477-88.
[8].Traxler， E.A.， et al. Nat Med， 2016. 22（9）： p. 987-90.
[9].Aubrey， B.J.， et al. Cell Rep， 2015. 10（8）： p. 1422-32.