小鼠杏仁核 补肾活血针刺法对SAMP8小鼠杏仁核蛋白质组学表达的影响
梁梅亭 朱宏 董克礼 李广诚
摘要：意图 调查补肾活血针刺法对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠SAMP8杏仁核蛋白质组学表达的影响，探寻针刺医治AD的潜在靶点蛋白。办法 30只6月龄雄性SAMP8小鼠随机分为针刺组和对照组，每组15只，针刺组选取“肾俞”“百会”“血海”“膈俞”进行干涉，对照组予以相一起刻捉抓影响。干涉8周后，取杏仁核，选用蛋白质组学技能判定差异蛋白质点。成果 与对照组比较，针刺组终究判定有9个差异蛋白质点，其间6个上调、3个下调，依据蛋白质数据库中供给的相关信息，差异蛋白质点功用首要触及线粒体能量代谢、氧化应激、β-淀粉样蛋白（Aβ）发生等方面。定论 补肾活血针刺法可调理杏仁核内多种蛋白质的表达，提示其或许是经过改进线粒体能量代谢、抗氧化应激、削减Aβ发生等来完成对AD的潜在医治效果。
关键词：阿尔茨海默病；补肾活血；针刺；SAMP8小鼠；杏仁核；蛋白质组学
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.03.013
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）03-0058-06
Abstract： Objective To observe the effects of Bushen Huoxue acupuncture method on amygdaloid protein expression in SAMP8； To explore the potential target protein for acupuncture treatment of Alzheimer disease （AD）. Methods Thirty six-month-old male SAMP8 mice were randomly divided into acupuncture group and control group， 15 mice in each group. Acupuncture group selected Baihui （GV20）， Shenshu （BL23）， Geshu （BL17） and Xuehai （SP10） to intervene. The control group was given the same time to catch and stimulate. After 8 weeks， the amygdala was extracted and the differential expression protein spots were identified by proteomic techniques. Results Compared with control group， acupuncture group eventually identified 9 differential expression protein spots， of which 6 up-regulated and 3 down-regulated. According to the relevant information provided in the protein database， the main function of differential expression proteins involved in the mitochondrial energy metabolism， oxidative stress， and production of Aβ. Conclusion Bushen Huoxue acupuncture method can regulate multiple protein expressions in amygdala， suggesting that it may be through improving mitochondrial energy metabolism， oxidative stress， reducing production of Aβ to realize the potential therapeutic effects on AD.
Keywords： Alzheimer disease； Bushen Huoxue； acupuncture method； SAMP8 mice； amygdala； proteomics
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是最常見的发呆类型之一，也是最常见的神经变性疾病，以回忆力减退、认知功用妨碍及品格改动为首要临床体现，其病理特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）脑内反常堆积构成的老年斑、Tau蛋白过度磷酸化导致的神经元纤维缠结以及神经元的广泛丢掉。AD详细发病机制现在尚不明晰。研讨发现，在AD中，杏仁核是最简单劳累，也是Aβ最早堆积的部位之一[1-2]，磁共振也发现AD患者杏仁核以每年3.79%的速度萎缩[3]，与此一起，杏仁核体积的下降与认知功用危害有关[4-5]。SAMP8小鼠是日本竹田俊男教授经过20代以上的近亲交配构成遗传布景和老化特征安稳的模型，体现快速老化症状[6]，它在前期阶段就开端呈现为与年纪相关的回忆力和学习才能的下降[7]，AD的症状和特征性病理体现如Aβ堆积、tau蛋白反常磷酸化和神经元的丢失也已证真实SAMP8小鼠中相同存在[8]。因而，SAMP8小鼠是较为抱负的AD动物模型[9]。
近年来，蛋白质组学技能越来越老练，可用于大规模蛋白质间相互效果的研讨，使其在寻觅药物医治靶点上得到广泛使用，但AD与杏仁核的联络及针刺干涉稀有报导。为此，本研讨选用蛋白质组学办法，调查补肾活血针刺法干涉AD模型SAMP8小鼠后杏仁核蛋白组学表达的改动，寻觅医治SAMP8小鼠的潜在靶点蛋白，为补肾活血针刺法医治AD奠定根底。
1 资料与办法
1.1 动物及分组
6月龄雄性SAMP8小鼠30只，清洁级，体质量20～25 g，天津中医药大学榜首隶属医院动物试验中心，动物合格证号0004678。适应性喂食1周后，将30只SAMP8小鼠依照随机数字表分为针刺组和对照组，每组15只。小鼠均养殖于垫锯木屑的饲料笼中，动物房内温度18～22 ℃，相对湿度40%～50%，确保足够的光照和通风，自在摄食饮水。本试验经中南大学湘雅三医院试验动物道德委员会的同意[同意号LLSC（LA）2014-028]。试验进程中操作依照科技部2006年公布的《关于善待试验动物的指导性定见》规范进行。
1.2 干涉
针刺组选取“百会”“血海”“肾俞”“膈俞”，“百会”向后平刺3～5 mm，“血海”“肾俞”直刺2～3 mm，“膈俞”以80°角斜向上刺2～3 mm，其间血海、肾俞、膈俞先影响左边穴道，次日再影响右侧，替换进行，小鼠穴道定位以及针刺深度参照《试验针灸学》中的“动物针灸穴道图谱”[10]。进针后，补泻办法参阅针刺办法量学规范[11]：“血海”“膈俞”施捻转泻法，施针起伏180～360°，施针频率50～60次/min；“肾俞”“百会”施捻转补法，施针起伏60～90°，施针频率120～150次/min，运针1 min，留针10 min。对照组小鼠进行与针刺组相一起刻、相同程度捉抓影响。各组每日做相应处理1次，第7日暂停1次，接连干涉8周。
1.3 首要试剂与仪器
蛋白提取试剂盒（南京建成生物工程研讨所），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物科技研讨所），复合双向凝胶电泳试剂（Amresco），复合质谱判定试剂碳酸氢铵（Sigma）。Imagescanner扫描仪（类型ImagescannerⅡ），Image Master 2D platinum 5.0凝胶图画剖析软件（Bio-Rad），Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS质谱仪（Applied Biosystem），Mascot MS/MS数据库查询软件（Matrixscience）。0.25 mm×13 mm华佗牌针灸针，姑苏医疗用品厂有限公司。
1.4 杏仁核蛋白提取
针刺干涉8周后，10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉小鼠，断颈处死，将小鼠全脑完好取出，置于小鼠脑模具（深圳瑞沃德）中，参阅小鼠脑立体定位图谱定位[12]，取出杏仁核安排，用蛋白提取试剂盒别离并纯化杏仁核蛋白质，将纯化的杏仁核蛋白质离心，超声破碎，再离心提取杏仁核蛋白质团块，-80 ℃冰箱保存备用。
1.5 双向凝胶电泳
将2组小鼠杏仁核总蛋白质参照Gorg A等[13]介绍的办法各进行3次双向凝胶电泳别离，经银染后得到布景明晰、分辨率高、重复性好的2-DE图谱各3块。运用ImageMaster 2D platinum 5.0软件对图谱进行图画剖析，将辨认取得的蛋白质点的面积、灰度等数据拟组成一张新的凝胶，在拟合凝胶图谱的根底上对各胶进行匹配剖析。
1.6 质谱剖析与蛋白质判定
将蛋白质点从凝胶上切开下来后，置于1.5 mL Eppendorf管中，制备好的样品在MALDI-TOF-MS质谱仪上剖析，在联网状态下使用Mascot MS/MS数据库查询，输入包含肽质量指纹数据*.DAT的文件，软件主动链接http：//www.matrixscience.com网站，回来查询成果。
2 成果
2.1 双向凝胶电泳成果
每张胶片得到>1000个蛋白质点，经过剖析发现绝大部分蛋白质点在相同方位上丰度是共同的，经过ImageMaster 2D platinum 5.0软件对凝胶图谱进行剖析发现，针刺组与对照组间有9个差异点（差异蛋白质点选取规范是为蛋白质的差异表达上升或许下降2倍以上且至少一起呈现在3次不同的试验中），与对照组比较，针刺组表达上调的6个，表达下调的3个。详见图1、图2。
2.2 质谱剖析及蛋白质判定成果
从针刺组中选定有待剖析的差异蛋白质点后，选用Ultraflex III TOF/TOF质谱仪对差异蛋白质点进行开始判定，测得各自肽质量指纹图谱（以1号编号蛋白为例，见图3）。将取得的蛋白质点肽质量指纹图谱用软件flex Analysis过滤基线峰、辨认信号峰。
使用BioTools软件查找uniprot数据库，经过蛋白质点肽质量指纹谱与蛋白质数据库的比较来判定蛋白质，得到Mascot得分（以1号编号蛋白为例，查找到出的蛋白质Mascot得分为171分，阐明成果判定牢靠，见图4）。
鏈接http：//www.matrixscience.com网站查找蛋白质点肽质量指纹图谱的匹配成果见图5。其间匹配分数≥55的蛋白质9个，功用触及线粒体能量代谢、氧化应激、Aβ发生等方面，包含序列安装结构组件50同系物（SAM50）、细胞色素b5（CYB5B）、星形胶质蛋白（GFAP）、NAD依靠去乙酰化酶2（SIRT2）、核不均一核糖核蛋白K（hnRNP K）、核不均一核糖核蛋白H2（hnRNP H2）、硫氧还蛋白1（TRX1）、原肌球蛋白1（TPM1）、脂筏蛋白（FLO1）。详见表1。
3 评论
AD属中医学“发呆”“愚痴”等领域。AD发病的首要中医病理根底是肾虚血瘀，并贯穿AD发病的全进程。本试验前期研讨标明，补肾活血针刺法能有用进步AD患者的回忆力、改进认知功用和日常日子自理才能[14]；一起能使AD模型SAMP8小鼠水迷宫试验躲避潜伏期缩短，改进其学习回忆才能[15-16]。补肾活血针刺法取肾俞、百会、血海、膈俞为根本穴道，其间肾俞为肾之背俞穴，有补肾助阳之功；百会处于人之头顶，在人体的最高处，手足三阳经及督脉的阳气在此交会，又叫三阳五会穴，三阳指手足三阳经，五会指五脏六腑的气血皆会于此，故影响百会有补肾通脑、开窍增智、行气活血之功；血海为血证要穴，膈俞为八会穴之血会，两者合作，活血通脉之功尤效。以上诸穴合作，共奏补肾活血之功。
杏仁核坐落海馬的前方和海马旁回沟的深部，侧脑室下角的前方。它与内侧颞叶、前额叶皮层、前扣带回、丘脑和下丘脑等许多脑区有着广泛的纤维联络。很多研讨标明，杏仁核在AD的发病进程中扮演了极为重要的人物，在前期AD患者中，杏仁核显着萎缩且萎缩程度和疾病症状严峻程度密切相关[17-20]。杏仁核参加了认知加工进程，能够调理回忆的编码、稳固和提取；别的，杏仁核或许在AD的非认知性精力行为症状中起着重要效果，如AD患者常呈现的焦虑、郁闷等非认知性症状与杏仁核密切相关[18]。大鼠杏仁核内打针Aβ25-35能制备出成功的类AD模型[21]，这也反证了杏仁核在AD发病进程中的重要效果。因而，在AD的研讨进程中，杏仁核是不可或缺的，具有重要的研讨含义。
线粒体的结构和功用反常在AD的病理进程中起着重要效果[22]。SAM50对保持线粒体形状、线粒体嵴的形状学、线粒体呼吸链酶复合物至关重要[23]。SAM50适量削减或许导致线粒体形状和嵴形状改动，而SAM50的严峻耗费或许影响线粒体呼吸链复合物，终究导致神经元线粒体结构功用紊乱[24]。本试验发现补肾活血针刺法能使SAM50表达上调，估测针刺或许经过调理线粒体形状结构来改进线粒体能量代谢妨碍，完成对AD的医治效果。
氧化应激被认为是AD的一个重要的上游致病要素。CYB5B是线粒体内外膜之间的首要电子传递者，参加生物体安排中一系列重要的氧化复原反响[25]。CYB5B活性下降会导致线粒体呼吸链电子传递妨碍，使电子漏增多，自在基发生增多，引起很多的活性氧在体内集合，诱发氧化应激，导致细胞逝世。TRX1是体内重要的抗氧化蛋白，能铲除过量的活性氧及过氧化氢[26]，减慢超氧化物歧化酶的下降，一起能修正过氧化的巯基蛋白，减轻氧化应激的损害。补肾活血针刺法能上调CYB5B、TRX1的表达，估测其或许是经过削减自在基发生、抗氧化发挥效果。
Aβ作为老年斑的首要组成成分，在AD的发病中起着极为重要的效果。FLO1是β-淀粉样蛋白前体发生Aβ的渠道，与Aβ在脑内的堆积呈正相关；FLO1削减可使Aβ发生削减，下降Aβ的毒性效果。GFAP在激活状态下能够发生Aβ[27]，而GFPA广泛激活是AD前期的一种体现[28]。GFAP是神经系统中含量最丰厚的细胞，其发生的Aβ在脑内的集合和老年斑的构成进程中起着重要效果[29]。本试验发现补肾活血针刺法下调FLO1、GFAP的表达量，提示补肾活血针刺法防治AD的效果或许是经过削减Aβ的发生来完成的。
综上，本试验选用比较蛋白质组学办法发现，经过补肾活血针刺法干涉能调理SAMP8小鼠杏仁核内多种蛋白质的表达，其功用触及线粒体能量代谢、氧化应激、Aβ发生等方面，这些或许是补肾活血针刺医治AD的潜在效果靶点蛋白。
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（收稿日期：2017-08-09）
（修回日期：2017-09-09；編辑：华强）