黄连粉祛痘 黄连提取物的中药生物药剂学分类系统研究

刘洋+尹秀文+王子禹+李雪莲+潘孟+李彦萍+董玲

[摘要]中药生物药剂学分类体系（CMMBCS）的优势之一，是将分类归属的研讨层面从单成分扩展到中药多成分，进而从多成分扩展到中药全体研讨层面。该研讨以黄连提取物中的生物碱为首要研讨方针，探求生物碱单一成分及黄连提取物中各生物碱成分的水溶解性及肠浸透性改变规则，并对黄连提取物全体做中药生物药剂学分类体系归属研讨。其间选用经典摇瓶法和高效液相色谱法测定生物碱单一成分及提取物中各生物碱成分的溶解度改变及分类，选用在体单向肠灌流法进行生物碱吸收定量研讨，一起选用自界说权重系数法对黄连提取物全体进行浸透系数核算。

[关键词]黄连提取物； 生物碱； 溶解性； 肠浸透性； 中药生物药剂学分类体系

[Abstract]One of the advantages of biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） is expanding the classification research level from single ingredient to multicomponents of Chinese herb， and from multicomponents research to holistic research of the Chinese materia medica In present paper， the alkaloids of extract of huanglian were chosen as the main research object to explore their change rules in solubility and intestinal permeability of singlecomponent and multicomponents， and to determine the biopharmaceutical classification of extract of Huanglian from holistic level The typical shakeflask method and HPLC were used to detect the solubility of single ingredient of alkaloids from extract of huanglian The quantitative research of alkaloids in intestinal absorption was measured in singlepass intestinal perfusion experiment while permeability coefficient of extract of huanglian was calculated by selfdefined weight coefficient method.

[Key words]extract of huanglian； alkaloids； solubility； intestinal permeability； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

生物藥剂学分类体系自被提出以来[1]，历经20余年的数据堆集和科学研讨，已成为化学药物根底研讨和研制中十分重要的东西之一[2]。其根据水溶解性及肠浸透性凹凸对药物进行分类，中心要素溶解度、溶出度和浸透性又别离代表了影响药物被吸收的程度、药物从制剂中开释的速度和药物穿透肠细胞的转运速度及药物吸收浓度的依存性[34]。为了遵循这种以吸收为精华的分类理念，并充沛结合中药多成分杂乱体系及中药临床效果实践的特征，课题组在2014年提出了“中药生物药剂学分类体系（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）”的学术理念[5]。CMMBCS的研讨以吸收与否为界，先在杂乱多成分环境下定性断定可吸收成分，再定量测定可吸收成分的水溶解性和肠浸透性数据然后进行科学归类，为提醒中药多成分吸收的相互影响及相关机制的根本研讨奠定根底。根据理论布景及“多成分层次差异比较法”的辅导，CMMBCS评论中药代表性方针成分、多成分环境下方针成分、复方全体3个层次之间的内部规则，然后树立CMMBCS猜测模型。

课题组以经典方 “葛根芩连方”为研讨载体，前期已对高含量成分葛根素的BCS特点[6]及多成分环境对其溶解度及浸透性的影响做了剖析[78]，对小檗碱单一成分、小檗碱在黄连药材中[9]、小檗碱在葛根芩连复方中[10]的CMMBCS特点做了系列研讨，一起经过离体法及在体法，开始断定了黄连水提液中可透过肠壁吸收并吸收入血的方针成分[11]。本研讨在前期研讨的根底上，以黄连提取物为研讨方针，对中药提取物CMMBCS特点进行探究与测定，并对与其相关的数学公式进行了使用与验证，以期为中药全体甚至中药复方的CMMBCS归属研讨供给数据与理论支撑。

1资料

11仪器

LC20AT高效液相色谱仪（SPD20A型紫外检测器，SIL20A自动进样器，日本岛津公司）；BT25S电子剖析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW4电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；981B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；STARTER2100试验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；打针泵（LSP021B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（SIGMA，德国）。

12试剂与药品endprint

盐酸小檗碱对照品（批号110713201212，我国食品药品检定研讨院，纯度868%）；木兰花碱对照品（批号M2903S1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；非洲防己碱对照品（批号Y13M6W1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；表小檗堿对照品（批号H25F3X1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸药根碱对照品（批号Z15T4B1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸黄连碱对照品（批号ZS0924BE14，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸巴马汀对照品（批号KS0922CF14，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸小檗碱质料（批号130808，陕西中鑫生物技术有限公司）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；纯净水（娃哈哈集团公司）；黄连提取物（试验室克己）；其他试剂均为剖析纯。

13试验动物

SD大鼠，雄性，体质量200～250 g，斯贝福（北京）生物技术有限公司供给，许可证号 SCXK（京）20160002。

2办法

21溶液的制备

211对照品溶液的制备

别离精细称定木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量置于量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后得质量浓度别离0203，0203，0100 4，0243，0102 4，0264，0400 g·L-1的各对照品储藏液。精细移取木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品溶液适量置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀备用，得混合对照品母液。

212不同pH缓冲液的制备

pH 10盐酸溶液：量取盐酸溶液9 mL，加水稀释至1 000 mL，即得；pH 40缓冲液：取一水枸橼酸1290 g，取磷酸氢二钠2725 g，加水1 000 mL溶解，即得；pH 68缓冲液：取磷酸二氢钾170 g和磷酸氢二钾178 g，加水溶解稀释至1 000 mL，即得；pH 74缓冲液：取磷酸二氢钾681 g，加01 mol·L-1氢氧化钠溶液395 mL稀释至1 000 mL，即得。KrebsRinger′s营养液（KR液）：称取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g；加蒸馏水定容至1 000 mL，调理pH到739～741，放置备用。

213黄连提取物的制备

课题组前期经过单要素与正交试验办法，断定黄连提取物的最佳制备办法。取黄连粉末25 g，以10倍量的80%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，得黄连总生物碱粗提物。选用AB8型大孔树脂，以径高比1∶7、上样浓度005 g·mL-1（生药浓度）、上样体积45 倍柱体积、吸附流速10 mL·min-1、水洗体积1倍柱体积、50%乙醇洗脱、洗脱剂用量4倍柱体积的工艺参数对粗提物进行纯化，富集黄连中的生物碱总量算计可达4895%。

22办法学调查

221生物碱单一成分生物样品的剖析办法学调查

2211色谱条件Waters Atlantis T3色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；活动相①木兰花碱及非洲防己碱：水溶液（03%磷酸05%三乙胺，调pH 30）乙腈（80∶20）；②表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱：水（03%磷酸05%三乙胺，调pH 30）乙腈（70∶30）；流速10 mL·min-1；检测波长265 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2212规范曲线的制作别离精细移取211项下7种生物碱对照品储藏液必定体积于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制造成一系列浓度的生物碱对照品溶液。别离精细汲取上述各对照品溶液10 μL进样，测定其峰面积。别离以木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各对照品溶液的质量浓度（mg·L-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，制作规范曲线并进行回归。

2213精细度试验取各对照品溶液，按上述色谱条件别离重复进样6次，记载峰面积，别离核算相对规范偏差（RSD）。

2214重复性试验精细称取各对照品制备其溶液各6份，别离精细汲取10 μL注入高效液相色谱仪，记载峰面积，别离核算RSD。

2215安稳性试验取各生物碱生物样品溶液别离于0，2，4，6，12，24 h进样检测，记载峰面积，别离核算RSD。

2216回收率试验取空白肠灌流液，别离参加不同量各对照品。高效液相测其含量，核算回收率及其RSD。

222黄连提取物生物样品的剖析办法学调查

2221色谱条件Waters Atlantis T3色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；活动相乙腈（A）水（B，含03%磷酸，05%三乙胺，调pH 30），梯度洗脱（0～2 min，13%A；2～4 min，13%～20%A；4～50 min，20%～25%A；50～55 min，25%～30%A；55～63 min，30%～70%A；63～65 min，70%～95%A；65～70 min，95%～13%A；70～80 min，13%A）；检测波长265 nm；流速06 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2222规范曲线的制作精细移取混合对照品母液010，050，100，200 mL别离置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用，与混合对照品母液一起制造成一系列浓度的混合对照品溶液。过022 μm微孔滤膜，精细取上述溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记载峰面积。别离以木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），制作规范曲线并进行回归。endprint

2223精细度试验取混合对照品溶液，按色谱条件别离重复进样6次，测定峰面积。

2224重复性试验取黄连提取物粉末5份，平行制备5份供试品溶液，按色谱条件测定峰面积。

2225安稳性试验精细汲取新制造的供试品溶液，别离在0，2，6，12，24 h按色谱条件测定峰面积。

2226加样回收率试验精细称取黄连提取物粉末700 mg，别离参加精细称定的7种生物碱对照品，平行操作5份，按色谱条件测定峰面积。

23溶解度测定

231生物碱单一成分平衡溶解度测定

取待测生物碱单一成分适量，置2 mL离心管中，精确参加pH 74缓冲液10 mL，（37±1）℃水浴加热，一起每隔5 min强力振摇30 s，调查30 min，至待测化合物不再溶解，将溶液置于室温条件下静置必定时刻后15 000 r·min-1离心15 min，别离参加pH 74缓冲液恰当稀释后，再经过15 000 r·min-1离心15 min，取上清液过045 μm微孔滤膜，注入高效液相色谱仪测定其溶解度。

232黄连提取物中各生物碱成分平衡溶解度的测定

黄连提取物平衡溶解度的测定选用经典摇瓶法，测定其在不同pH介质（pH 10缓冲液、pH 40缓冲液、pH 68缓冲液、pH 74缓冲液及水）中的平衡溶解度。取黄连提取物适量，置10 mL具塞试管中，参加不同pH 缓冲液50 mL（精确参加量），（37±1）℃水浴加热，一起每隔5 min强力振摇30 s，调查30 min，至待测化合物不再溶解，将溶液置于室温条件下静置必定时刻，别离取1 mL溶液置于离心管中，15 000 r·min-1离心15 min，参加相应的介质恰当稀释后，再经过15 000 r·min-1离心15 min，取上清液过045 μm微孔滤膜，注入高效液相色谱仪测定其溶解度。

31办法学剖析

成果表明，生物碱单一成分中，木兰花碱在199～1592 mg·L-1线性联系杰出，R2=0999 8；非洲防己碱在199～1989 mg·L-1线性联系杰出，R2=0999 9；表小檗碱在197～1771 mg·L-1线性联系杰出，R2=0999 7；盐酸药根碱在095～1905 mg·L-1线性联系杰出，R2=10；盐酸黄连碱在201～2408 mg·L-1線性联系杰出，R2=0999 9；盐酸巴马汀在103～5174 mg·L-1线性联系杰出，R2=10；盐酸小檗碱在694～10404 mg·L-1线性联系杰出，R2=0999 8。木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的精细度RSD别离为072%，060%，13%，030%，043%，043%及054%，重复性RSD别离为099%，11%，16%，18%，11%，11%及15%，安稳性RSD别离为038%，075%，060%，036%，039%，034%，048%。仪器精细度及办法重复性杰出，样品在24 h内安稳，加样回收率9545% ～ 1004%，RSD均小于30%。

黄连提取物中的各个生物碱木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱在025～1235，016～796，048～2389，015～747，060～2999，042～2117，139～6936 mg·L-1线性均杰出，R2别离为0999 1，0999 5，0999 9，0999 6，0999 4，0999 4，0999 4，精细度RSD依次为028%，095%，17%，18%，054%，047%，027%，重复性RSD依次为14%，19%，20%，30%，17%，18%，15%，安稳性RSD依次为071%，11%，30%，27%，18%，10%，022%。仪器精细度及办法重复性杰出，样品在24 h内安稳，加样回收率9613% ～ 1055%，RSD均小于30%。

32溶解度成果

321生物碱的平衡溶解度

因为后续灌流试验中所选用的KR液pH为74，因而挑选 pH 74缓冲液作为各单一成分溶解度测定的pH 介质。而各生物碱单一成分在黄连提取物的环境中，溶解度因介质pH的不同而不同，成果见表1。单一成分溶解度与其在提取物这一多成分环境中的溶解度有所不同，成果见表2。

表

由成果剖析可知，黄连提取物中各生物碱成分的溶解度在pH 10时最小，在水中溶解度最大。黄连提取物中各生物碱的溶解度均随pH的增大根本呈增大趋势，溶解度曲线趋势类似；各生物碱单一成分的平衡溶解度与其在黄连提取物中的平衡溶解度比较均有明显性差异，其间木兰花碱、盐酸药根碱及盐酸巴马汀在提取物中的溶解度明显减小，而非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱及盐酸小檗碱的溶解度明显增大。尤其是盐酸小檗碱，其在黄连提取物中的平衡溶解度较其单一成分溶解度提高约15倍，或许与其自身溶解度较大且在提取物中含量最高有关（相对于提取物中的其他生物碱）。此成果与课题组前期研讨成果[9]相一致，表明晰黄连中其他成分有利于盐酸小檗碱溶解度的添加。

322黄连提取物的溶解度及剂量数D0

由321项成果可知，黄连提取物中各生物碱成分的溶解度在pH 10时最小。根据各生物碱测得的平衡溶解度及其在黄连提取物中的含量可核算黄连提取物浓度，根据公式（1）Cs的界说，以黄连提取物中各成分在pH 10缓冲液中的溶解度核算黄连提取物的溶解度，成果见表3。

由以上成果可知，各生物碱到达平衡溶解度时各自对应的黄连提取物的浓度/溶解度不同，则在各自对应的最大的黄连提取物浓度/溶解度状态下，即可确保各生物碱成分溶解彻底。当黄连提取物质量浓度为15693 g·L-1时，黄连提取物中各生物碱成分均已到达饱和状态，故断定黄连提取物的最小溶解度为15693 g·L-1。endprint

药典中凡例项下二十七项规则“饮片的[用法与用量]，除还有规则外，用法系指水煎内服；用量系指成人一日常用剂量，必要时可根据需求酌情增减。”药典中黄连用量为2～5 g，外用适量。因而，取5 g为黄连的最大用药剂量，相当于克己黄连提取物的0787 g。因而，黄连提取物的剂量数D0经公式（1）核算，为0201。黄连提取物D0<1，归于高溶解度。

33浸透性成果

331生物碱的有用浸透系数

用KR试液制造黄连提取物溶液，调查质量浓度015 g·L-1（低浓度）、03 g·L-1（中浓度）和045 g·L-1（高浓度）的黄连提取物在体肠吸收状况，成果见表4。

为便于与黄连提取物中生物碱的浸透性进行比较，单一生物碱成分的研讨仅选取大鼠空肠为灌流方针，中浓度肠灌流液为浓度参照。因为盐酸黄连碱和盐酸小檗碱在KR营养液中的溶解度问题，其二者的肠灌流液浓度以低浓度中各生物碱的浓度为参照。浸透系数Peff测定成果见表5。

332黄连提取物的浸透系数Peff

以中浓度黄连提取物在空肠的浸透系数进行核算，成果见表6。

由以上成果可得，黄连提取物以生物碱类成分进行浸透性分类归于低浸透性，各单一成分的有用浸透系数Peff均低于美托洛尔。在提取物这一多成分环境中，各成分的浸透性提高均不高。

4评论

黄连提取物中各生物碱的溶解度在pH 10缓冲液中较低，在pH 68以上的碱性环境中各生物碱成分的溶解度明显增大。在pH 74缓冲液中各生物碱单一成分与在提取物中各成分的溶解度均有较为明显的改变。估测除了生物碱成分的相互效果外，黄连提取物中的不知道成分也或许存在增溶或减溶效果。而各生物碱单一成分与黄连提取物中各成分的浸透性，除木兰花碱及表小檗碱外，其浸透系数Peff无明显性差异，木兰花碱及表小檗碱的吸收参数有明显差异，但各个生物碱的浸透系数Peff数量级均在10-4等级，且均小于05×10-4 cm·s-1，仍为低浸透性药物。可见，在黄连提取物中各成分的浸透性并未呈现数量级的改变，各成分间的相互效果或许提取物中其他不知道成分对浸透性的影响不大。

归纳黄连提取物的溶解度和浸透性研讨成果，黄连提取物在pH 10缓冲液中的溶解度为15693 g·L-1，据此取得的剂量数D0为0201，小于1，归于高溶解度；黄连提取物在空肠的浸透系数为0146×10-4 cm·s-1，低于美托洛尔浸透系数，归于低浸透性，故将黄连提取物归属为CMMBCS Ⅲ类。本研讨在进一步丰厚和完善CMMBCS顶层研讨的一起，还可挖掘出从单一成分固有性质到多成分环境下改变的CMMBCS的实质特征特点，对点评中药成分的吸收状况及证明成分配伍影响吸收的趋势供给根底根据。经过成分间生物药剂学的联系研讨，为往后优化出相互促进的多成分物质根底组分及现代中药立异种类的开发供给研制体系、科研形式的根底推进效果。

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[责任编辑孔晶晶]endprint