裸鼠移植瘤 补中益气汤对A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF—κB，caspase—9，Survivin，mTOR表达的影响
刘亚莉+易佳丽+刘春英
[摘要] 探討补中益气汤对A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR表达的影响。BALB/C裸鼠60只随机分为空白对照组、荷瘤对照组、顺铂组和补中益气汤高剂量+顺铂组（高联组）、补中益气汤中剂量+顺铂组（中联组）、补中益气汤低剂量+顺铂组（低联组），培育A549/DDP细胞（浓度为5×106个/mL），接种于各组，调查各组成瘤状况。给予相应医治，14 d后取瘤安排固定、切片，免疫安排化学办法、Real-time PCR办法检测各组裸鼠移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR 蛋白和mRNA的表达水平。成果显现补中益气汤联合顺铂可下降移植瘤体积，中联组和高联组的抑瘤率与顺铂组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；与荷瘤对照组比较，中联组和高联组Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的蛋白和mRNA的表达显着削减（P<0.05），caspase-9的蛋白和mRNA在中联组和高联组的表达逐步增多，与荷瘤对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；Bad，NF-κB，caspase-9的mRNA，中联组和高联组与顺铂组、低联组、荷瘤对照组比较有统计学含义（P<0.05），低联组、顺铂组、荷瘤对照组两两比较，无统计学差异，各因子蛋白和mRNA的表达中联组和高联组比较，无统计学含义。成果标明补中益气汤与顺铂联合效果可按捺A549/DDP移植瘤的成长，补中益气汤按捺A549/DDP移植瘤的效果或许是经过调理Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR，促进细胞凋亡完结的。
[关键词] 补中益气汤； A549/DDP； 裸鼠； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR
[Abstract] This study was aimed to explore the effects of Buzhong Yiqi decoction on the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR in nude mice with A549/DDP transplantation tumors.Sixty BALB/C mice were randomly divided into blank control group， tumor-bearing control group， cisplatin group and Buzhong Yiqi decoction of high， medium and low doses+cisplatin groups （hereinafter referred to as the high，medium and low combined groups）. A549/DDP cells （concentration of 5×106 cells/mL）were cultured and inoculated in various groups， then the tumor-forming situations were observed. Corresponding treatment was given in all groups. Fourteen days later， immunohistochemistry and Real-time PCR methods were used to detect the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， mTOR protein and mRNA in tumors.Results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin could reduce the volume of transplanted tumors， and there was significant difference between medium combined group and high combined group（P<0.05）. As compared with the tumor-bearing control group， the expression levels of Bad， NF-κB， Survivin and mTOR were significantly reduced in medium and high combined groups（P<0.05）； the protein and mRNA expression levels of caspase-9 were gradually increased in medium combined and high combined groups（P<0.05）， with statistical difference with tumor-bearing control group（P<0.05）. There were statistical difference in mRNA expression of Bad， NF-κB and caspase-9 between medium combined group， high combined group and cisplatin group， low-combined group， tumor-bearing control group（P<0.05）， but there was no statistical difference between cisplatin group， low-combined group， and tumor-bearing control group. In addition， there was no statistical difference between medium combined group and high combined group in protein and mRNA expression levels of various factors. Experimental results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin can inhibit the growth of A549/DDP transplanted tumors， and the mechanism may be associated with regulating Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR levels as well as promoting apoptosis.
[Key words] Buzhong Yiqi decoction； A549/DDP； nude mice； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR
肺癌已成为要挟居民健康的首要疾病之一，其发病率的上升趋势与吸烟等不良日子方法的增多、空气质量下降等要素有关[1]。肺癌作为肿瘤逝世的首要原因，遭到全世界的广泛研讨。肺癌由于不易及早发现，在失掉手术医治时机时就只能以放、化疗为主。化疗的客观有用率约30%，中位生计期8～10个月，1年生计率30%～40%，且不良反响较严峻，大都患者难以完结有用的医治周期[2]。袁惠芳等[3]发现选用培美曲塞联合铂类计划医治晚期肺癌时加以补中益气汤辅佐，可在必定程度上进步联合用药效果，并显着减轻化疗所造成的胃肠反响，下降不良反响发作危险，进步患者医治期间日子质量。刘明等[4]研讨发现化疗联合补中益气汤加减在医治中晚期非小细胞肺癌时临床效果有所进步，而且在显着改进患者日子质量的基础上有用下降骨髓按捺的发作率。
本研讨将人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP细胞接种裸鼠，制备成荷瘤模型，用不同浓度的补中益气汤和顺铂进行干涉，将顺铂作为阳性对照，选用一般性调查、免疫安排化学、Real-time PCR等办法，点评补中益气汤对移植瘤成长的影响，并评论其效果机制，为使用补中益气汤干涉肺癌顺铂耐药供给试验根据。
1 材料
1.1 动物及细胞 BALB/C裸鼠，SPF级，5周龄，男女参半，体重（20±2） g，购自北京维通利华动物试验技能中心，动物许可证号SCXK（京）2012-0001，A549和A549/DDP细胞株购自我国医学科学院肿瘤研讨中心细胞库。
1.2 药物制备 补中益气汤生药购于辽宁中医药大学隶属医院药房，组成参照《方剂学》新世纪版规则，按“动物与人体的每千克体重剂量折算系数表”[5]，核算裸鼠的等效剂量，按成人日引荐量的2，1，1/2倍设置高、中、低剂量组。惯例煎制成每毫升含生药3.939，1.970，0.985 g。
1.3 仪器及试剂 formaUL-1168751H CO2孵育箱（Thermo Fisher Scientific美国）；PE 9700PCR扩增仪（美国）；KOHTRON高速低温离心机（瑞典）；BT-31恒温水浴振动仪（日本，KAMAMOTO）；紫外分光光度计（英国UV-visible Spectrometer，UV300）。Survivin抗体、mTOR抗体（南京凯基生物技能有限公司），鼠抗人Bad，NF-κB，caspase-9单克隆抗体（PTGLAB公司），Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR荧光定量PCR试剂盒[宝生物工程（大连）有限公司]，引物组成由北京华大基因公司供给。打针用顺铂（齐鲁制药厂出产，出产批号2030132DB）。
2 办法
2.1 细胞悬液制造人肺腺癌耐药细胞株 A549/DDP按惯例5%CO2，37 ℃孵育箱中培育，每2 d换液1次，0.25%胰蛋白酶消化，3～4 d传代1次。传代扩增细胞数量至满足时，搜集对数成长期A549/DDP细胞，0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，去上清液，以PBS洗刷，调整细胞浓度为5×106个/mL，制备成A549/DDP细胞悬液。
2.2 移植瘤制备及標本搜集 60只裸鼠适应性喂食1周后，按随机数字表法分为6组：①空白对照组，②荷瘤对照组，③顺铂组，④补中益气汤高剂量+顺铂组（高联组），⑤补中益气汤中剂量+顺铂组（中联组），⑥补中益气汤低剂量+顺铂组（低联组），每组10只。①组裸鼠给予腹股沟皮下接种0.2 mL/只生理盐水；②～⑥组裸鼠给予腹股沟皮下接种A549/DDP细胞悬液0.2 mL/只。调查各组成瘤状况，待肉眼调查到移植瘤呈现时，空白对照组、荷瘤对照组给予生理盐水0.5 mL灌胃；顺铂组给予等量生理盐水灌胃的一起，腹腔打针顺铂2 mg·kg-1；高联组、中联组、低联组别离给予高、中、低浓度的补中益气汤0.5 mL灌胃，一起腹腔打针顺铂2 mg·kg-1，每日1次，14 d后，无菌剥离瘤体，称瘤重，游标卡尺丈量肿瘤最大长径（a）和横径（b），瘤体标本部分用10%福尔马林固定，白腊包埋切片，免疫组化检测；部分敏捷置于-80 ℃冰箱保存，做Real-time PCR。
2.3 免疫组化办法检测移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR的表达 取出固定样本，经惯例脱水，通明、浸蜡，包埋后，将每个样本蜡块接连切片3张，每张厚约4～5 μm。切片惯例脱蜡至水，PBS清洗5 min，2次，高压热修正，内源性过氧化物酶阻断，PBS清洗5 min，2次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗5 min，2次，加二抗37 ℃孵育45 min，PBS清洗5 min，2次，DAB显色，通明后封片。以PBS替代一抗作为阴性对照组。免疫组化成果选用Image Pro Plus医学图画剖析体系进行图画剖析，在400倍高倍镜下，别离测出阳性反响细胞的总面积（Area） 和积分光密度（IOD），求出均匀光密度（AOD）。
2.4 Real-time PCR技能检测各组移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR mRNA的表达 使用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物，PCR 引物见表1。取各组样品，别离进行总RNA的提取，待样本纯度检测核算合格后，按反转录试剂盒阐明进行反转录组成cDNA，反响条件37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，1个循环。进行PCR扩增，反响条件为95 ℃ 0.5 min，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，1个循环；PCR扩增的反响体系为20 μL。各基因完结PCR扩增循环后，进行产品熔解曲线剖析，以断定产品纯度。根据PCR产品熔解曲线的均匀熔解温度断定产品的纯度。根据体系给出数值，核算各组mRNA的表达比率，进行剖析。
2.5 统计学剖析 运用SPSS 16.0软件对数据进行统计学剖析。计量材料选用±s标明。各组数据契合正态分布，方差齐时，选用单要素方差剖析，两两比较选用SNK法；不契合参数查验者，选用多组计量材料秩和查验。P<0.05为有统计学含义。
3 成果
3.1 补中益气汤对荷瘤裸鼠一般状况的影响 各组试验动物活动杰出，未见显着的拒食、不安、便溏现象。高联组裸鼠体重与空白对照组比较，无显着改变，各组间无统计学差异。致瘤率以试验结束时，解剖出瘤安排并经HE染色证明为规范，高联组有2只，中联组有1只，未呈现瘤安排，从样本含量上给予除掉。跟着补中益气汤剂量的添加，移植瘤体积减小，高联组、中联组抑瘤率与顺铂组比较差异有统计学含义（P<0.05），低联组与顺铂组比较则无显着差异，见表2。
3.2 免疫安排化学办法检测各组移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR蛋白表达 各组Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的表达显现，各组中均有棕黄色颗粒表达，荷瘤对照组最多，顺铂组和低联组表达量有所削减，而中联组和高联组表达最少。统计学剖析显现，中联组和高联组与荷瘤对照组、顺铂组、低联组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；低联组、荷瘤对照组、顺铂组两两比较无统计学差异；中联组和高联组比较则无统计学含义，见图1～5。
caspase-9蛋白在各组中的表达状况为：荷瘤对照组中棕黄色颗粒最少，中联组和高联组棕黄色颗粒最多，顺铂组和低联组居中。经统计学剖析：中联组和高联组与荷瘤对照组、低联组和顺铂组比较有统计学差异（P<0.05），低联组、顺铂组和荷瘤对照组两两比较则无统计学含义。见图3，6。
4 评论
在肺癌的化疗进程中，耐药和毒副反响是多种多样的。如胃口减退、吐逆、骨髓按捺等。对补中益气汤的研讨许多，沈富林等[7]研讨证明，在多种肿瘤的联合化疗计划中选用补中益气方，均可有用减轻化疗的毒副反响。除此之外，将单纯化疗法和化疗联合补中益气汤法进行比照研讨，可以发现，与单纯化疗组比较，联合组患者毒副反响的发作率显着下降，李雁等[8]进行的相关研讨证明了此成果。一起，还有很多的研讨标明，在肿瘤尤其是肺癌的化疗计划中，使用补中益气汤药不光缓解患者在化疗期间的不适反响，还可进步放疗耐受性，特别是可以削减放射医治所造成的炎症反响[9]。本研讨以先天性缺少胸腺的裸鼠为研讨目标，选用典型的肺腺癌细胞系A549/DDP细胞，以皮下移植的方法造模，呈瘤率都在90%以上。在添加了补中益气汤的干涉后，与顺铂组比较，抑瘤率显着添加，差异有统计学含义（P<0.05），提示补中益气汤与顺铂的抑瘤效果有协同效应。免疫组化的成果标明，顺铂联合补中益气汤干涉后Bad，NF-κB，Survivin，mTOR蛋白的表达显着削减，caspase-9蛋白的表达增多，与顺铂组比较有统计学差异（P<0.05），提示联合使用顺铂和中、高剂量的补中益气汤后，下调了肿瘤安排中抗凋亡因子Bad，NF-κB，Survivin，mTOR等因子的表达，而且上调促凋亡因子caspase-9的表达，而在基因检测方面，Real-time PCR的成果显现以上各因子mRNA的表达与蛋白表达的改变是一起的，提示补中益气汤对肺癌顺铂耐药相关因子的干涉是在基因水平上发作的，添加肿瘤细胞的凋亡，然后使瘤安排体积缩小。
顺铂在进入肿瘤细胞之后，与细胞的DNA构成加合物并激起细胞周期的中止和凋亡进程的发动，所以在此进程中，阻止顺铂与DNA的加合物构成，或其调理肿瘤细胞周期引发肿瘤细胞凋亡的要素都有或许引起顺铂耐药[10]。核因子-κB（NF-κB）是广泛存在于真核生物中的一种多功能的核转录因子，在恶性肿瘤的发作、开展和搬运中有重要的促进效果，这是由于NF-κB可以操控多种细胞因子和生计基因表达[11]。Survivin是一种在肿瘤内皮细胞中继续表达的特异性凋亡按捺因子，按捺Survivin的表达可有用削减肿瘤血管的生成，有研讨证明，肿瘤细胞中大大都血管生成或按捺因子都是经过调理Survivin的表达来发挥效果的[12]。王淳等[13]研讨发现补中益气汤含药血清可激活A549 细胞内caspase-3依靠的细胞凋亡发作，其效果是经过进步A549细胞ROS水平，并激活其下流各级激酶发生的。王雨等[14-15]研讨发现补中益气汤不光可上调caspase-9 mRNA和蛋白表达水平，也可添加caspase-3 蛋白的表达，然后使二者一起效果，增强诱导肿瘤细胞凋亡的效果。促凋亡蛋白Bad经过结兼并灭活抗凋亡的Bcl-2宗族蛋白发挥促进凋亡的效果。在之前的研讨中，本课题组现已论述补中益气汤或许经过调控PI3K，AKT基因和蛋白的表达而干涉顺铂的耐药机制，而且这种干涉效果具有必定的量效联系[16]。PI3K/AKT通路可导致细胞凋亡的按捺，顺铂与肿瘤细胞的DNA结合后，即DNA收到了损害，这种损害信息可激活PI3K/AKT通路，然后引起细胞凋亡阈值增高，发生了对顺铂的耐受。本研讨为了解补中益气汤在PI3K/AKT信号转导通路中的效果，检测了此通路下流促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR在补中益气汤干涉时表达的改变，为解说临床使用补中益气汤改进肺癌顺铂耐药供给试验根据。
综上，补中益气汤按捺肺癌肿瘤成长的效果，或许是经过调理A549/DDP细胞中的促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR，促進肿瘤细胞凋亡而完结的，补中益气汤是培土生金法的代表方药，对肺癌患者补虚扶正、培本固元、改进患者日子质量、反转肺癌顺铂耐药的效果，值得进一步研讨。
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