愈伤安排的特色 款冬叶柄愈伤安排培养与再生系统树立
任继文 雷颖 李晓玲
[摘要]以款冬稚嫩叶柄为资料，研讨植物成长调节剂对其离休培育与植株再生的影响，树立了款冬离体快繁技能系统。成果标明：款冬叶柄切段较抱负的灭菌办法为75%乙醇浸泡30 s，转入饱满漂白粉上清液浸泡15 min；合适愈伤诱导的培育基为MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1，诱导率962%；在培育基MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1上芽苗分解作用较好，分解率91%，均匀芽数826个；较佳的不定芽增殖培育基为MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，增殖倍數为1181，均匀苗高49 cm；生根培育基为1/2MS+IBA 02 mg·L-1，生根数均匀为568条，生根率为9522%以上；瓶苗移栽于河沙有机肥 3∶1的基质中成长杰出，成活率达90%以上；大田实验标明：平等培育条件下款冬组培株、培育株和野生株在成长量与花粒产值等方面存在显着差异，以组培株成长量与花粒产值相对较高。组培品与野生品有用成分含量根本共同。
[关键词]款冬； 稚嫩叶柄； 愈伤安排诱导； 植株再生； 成长量； 有用成分测定
[Abstract]Young petiole of Tussilago farfara was used as the material to investigate the plant growth regulators which could influence in vitro culture and plant regeneration and to establish rapid propagation technique The ideal sterilization method was that young petiole of T farfara was sterilized with 75% ethanol for 30 s， and then transferred to saturated bleaching power supernatant for 15 min The suitable medium for callus induction was MS+6BA 30 mg·L-1+2，4D 20 mg·L-1 with 962% induction rate The seedlings had better differentiation with 91% differentiation rate and 826 buds on the medium containing MS+ZT 20 mg·L-1+NAA 03 mg·L-1 The preferred enrichment medium of adventitious bud was MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1with 1181 enrichment times and 49 cm seedling height The rooting medium included 1/2MS+IBA 02 mg·L-1 with the average number of rooting was 586 and the rooting rate was above 9522% The container seedlings can grow well and the survival rate was more than 90% when they were transplanted on the medium added with river sand and organic fertilizer with the ratio of 3∶1. The field experiments indicated that significant differences in increment and yield of pollen grains among the tissueculture， cultivation and wild type of T farfara under the same cultivation conditions The cultivated plants were relatively high on the increment and yield of pollen grainsThe active ingredient contnet of the tissue culture and the wild materials was basically the same.
[Key words]Tussilago farfara； young petiole； callus induction； plant regeneration； measure； active ingredients
款冬Tussilago farfara Linn，又叫款冬花，冬花，多年生草本，为菊科款冬花属植物[1]，其枯燥花蕾，是我国传统的中药材，性味辛温，归肺经，具化痰止咳，润肺下气之成效，主治咳嗽、气喘、咳吐痰血等症[2]。亦可作为地被植物，用于花坛美化[3]。跟着在中成药，中药配方中运用的扩展，其需求量不断增大，现在产品款冬花以人工培育为主，选用根茎无性繁衍，但质量逐年下降，而野生种质是丰登、优质、抗耐性质量的重要来历，但由于人为和天然等要素，野生资源逐步削减，因而，促进中药工业的可持续发展，施行款冬花资源的维护和快速繁衍，已刻不容缓。对款冬花安排培育与快速繁衍的实验研讨，现在还未报导见。本文运用野生款冬叶柄为资料，进行安排培育实验研讨，以期取得高效再生系统的树立。
1资料
培育资料采自甘肃小陇山林区。初夏，采摘款冬当年生幼叶，用清水冲去外表尘埃后备用。endprint
2办法
21无菌资料的取得
款冬叶片上外表被蛛丝状毛，下外表及叶柄被白色毡毛，灭菌较为困难，因而在消毒液的各处理中参加2滴聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）[4]以加快消毒剂的滋润作用。本次实验选用2要素3水平彻底随机实验规划[5]，设置75%乙醇处理30 s，01%HgCl（60，180，300 s），漂白粉上清液（600，900，1 200 s），共12个处理，每处理10瓶培育基，每瓶接1块外植体，重复3次。接种2周后查看污染率与褐变率。
22培育条件
培育基中参加3%的蔗糖，生根培育时加2%[6]，琼脂6 g·L-1，pH 58，愈伤诱导阶段pH 56[7]；培育温度为（22±2） ℃，光周期12 h/12 h （光/暗），生根培育时16 h/8 h （光/暗）；光照强度：愈伤诱导时约20 μmol·m-2·s-1 [8]，其他各阶段为50 μmol·m-2·s-1。
23愈伤安排培育
消毒灭菌所得的资料置于铺有无菌滤纸的接种盘中，切去两端褐化部分，将剩下部分切割成05～10 cm的小段[9]，接种到愈伤诱导培育基中，愈伤安排诱导以MS为根本培育基，选用6BA与2，4D的2要素3水平随机规划，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种1个外植体，重复3次。弱光下培育 40 d后调查。愈伤安排诱导率=构成愈伤安排的外植体数/接种后未被污染的外植体数×100%，接种后7 d记载成长状况[10]。
24不定芽分解培育
将外植体培育40 d后发生的优质愈伤安排块转接到不定芽分解培育基上。分解培育以MS为根本培育基，参加不同浓度的ZT与NAA，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种1块愈伤安排，重复3次。培育40 d后调查并核算分解率和均匀芽数，不定芽分解率=萌发的愈伤安排块/接种的愈伤安排块×100%； 均匀芽数=萌发总数/接种块数。
25嫩茎的增殖培育
将分解培育所得的簇生芽切下，较长嫩茎切成10cm左右的小段，转入增殖培育基上培育。增殖培育以MS为根本培育基，添加不同浓度的KT与IBA，共9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种3块幼茎，重复3次。培育40 d后调查并核算增殖倍数与均匀苗高，增殖倍数=培育添加节位数（或芽苗数）/接种时节位数（或芽苗数）； 均匀苗高=苗高总和/总苗数。
26试管苗生根
当不定芽长到2～3 cm时，切下芽苗转接到生根培育基上培育。生根培育以1/2MS为根本培育基，添加不同浓度的IBA和IAA，共6个处理，每个处理10瓶，每瓶接3～5条嫩茎，重复3次。培育30 d后调查并核算生根率与均匀根数，生根率=生根茎段数/接种茎段数×100%； 均匀根数=每处理生根总数/诱导生根的总苗数。
27移栽
将生根的瓶苗不开盖在炼苗室放置2～3 d，然后翻开盖再放置2～3 d，取出苗，洗净根部培育基，移栽到河沙有机肥 3∶1的基质中，坚持环境温度在20 ℃左右，相对湿度90%～100%，恰当遮荫，每天下午通风，逐步添加光照。核算移栽成活率=移栽成活数/总移栽数×100%。
28成长量测定
4月初，挑选相同立地条件的实验地块，设置9个区组，每组5个小区，别离将平等巨细的组培苗、培育苗及野生苗移栽与实验小区内，每区组1个类型，重复3次。11月中旬核算测算各类型的成长量及花芽产值。各类型随机抽取10个样地，各样地面积1 m2，测算资料包含10个样地款冬的总株数。
29有用成分测定
291定性测定取组培和野生款冬花样品适量，破坏（过20目筛）、60 ℃枯燥到恒重，别离精细称取各样品1 g，用甲醇提取，浓缩后作为样品液。另取芦丁对照品，甲醇溶解为1 g·L-1溶液，作为对照品液。将样品液、对照品液点于同一硅胶G薄层板上，别离以醋酸乙酯甲酸水（10∶3∶3）和醋酸乙醋甲酸水（30∶1∶1）为打开剂，进行显色实验。
292定量测定选用美国TSP公司高效液相色谱仪，KeystoneODS色谱柱（46 mm×250 mm），预柱（15 mm），活动相甲醇03%磷酸水溶液（50∶50），流速1 mL·min-1，柱温为室温，检测波长360 nm，灵敏度002 AUFS。
在对照品溶液测定的芦丁峰面积与进样量有杰出的线性关系，且精细度、重复性、收回率实验均符合要求的前提下，对组培品和野生品进行测验。
称取组培和野生款冬样品各1 g，别离置于100 mL圆底烧瓶中，加适量甲醇回流4 h，过滤，收回溶剂至干，再加甲醇盐酸（4∶1）25 mL，回流30 min，过滤，滤液定容至50 mL，微孔滤膜过滤，得供试品溶液。别离精细汲取供試品液和对照品溶液（002 g·L-1）各20 μL，注人色谱仪测定，以外标法核算含量。
3成果
31不同消毒剂对外植体灭菌的影响
在超净工作台大将清水冲洗过的幼叶剪去叶片，叶柄剪成2～3 cm小段，放入各处理的消毒瓶中，按规划方案（表1）进行消毒灭菌后，接种于相应的培育基中，01%升汞和饱满漂白粉上清液的各处理独自运用时污染率都相对较高，与75%乙醇合作运用时作用显着进步，各处理在P<001水平上差异显着，75%乙醇+01%升汞各处理污染率显着小于75%乙醇+饱满漂白粉上清液，但褐变率却显着高于后者，归纳剖析本轮实验成果，75%乙醇30 s+饱满漂白粉上清液900 s是款冬叶柄外植体较抱负的消毒实验组合。
32不同植物成长调节剂组合对愈伤安排诱导的影响
挑选灭菌实验中所得的无菌资料转接到愈伤诱导培育基中，1周后叶柄切段肥壮，下端切断处有澎大的愈伤现象（图1A），40 d后调查，各处理愈伤安排块显着增大，但不匀一，部分愈伤块淡黄绿色、较细密、且外表有小疣突。 6BA和2，4D对愈伤安排诱导的作用显着，诱导率及均匀直径随6BA和2，4D浓度的升高而增大，但当两者质量浓度别离大于30和20 mg·L-1时，诱导率下降，愈伤安排松懈通明，失去了不定芽分解的才能（表2）。归纳分endprint
析标明，MS+2，4D 20 mg·L-1+6BA 30 mg·L-1是较为抱负的愈伤安排诱导培育基，诱导率为962%，愈伤安排块大、细密，外表有小疣突，有较好的不定芽分解才能（图1B）。
A培育2周的外植体； B培育40 d的愈伤安排块；C不定芽分解20 d；D不定芽分解40 d；E继代培育40 d； F生根培育30 d；G培育30 d的根形状； H炼苗第5天；I移栽成活的试管苗。
33不同植物成长调节剂组合对不定芽分解的影响
将淡黄绿色较细密的愈伤安排转接于分解培育
基上，20 d后有少数不定芽发生（图1C），40 d长出密布的绿色不定芽（图1D）。ZT和NAA对芽苗分解有显着影响，在不同植物成长调节剂组合中，以添加ZT 20 mg·L-1，NAA 03 mg·L-1的MS培育基较合适不定芽的分解，分解率为91%，均匀芽数826个，芽苗成长强健（表3）。
34不同植物成长调节剂组合对嫩茎增殖的影响
KT与IBA对芽苗增殖的影响显着，增殖倍数随其浓度的升高而添加，但当KT和IBA质量浓度别离大于10，03 mg·L-1时，增殖倍数下降，且发生一定数意图玻璃苗，基部有较多愈伤安排（表4）。因而，归纳考虑以上实验成果，款冬芽苗增殖培育较适合的培育基为MS+KT 10 mg·L-1+IBA 03 mg·L-1，芽苗成长强健，叶色深绿，增殖倍数为1181左右，均匀苗高490 cm左右（图1E）。
35试管苗生根与移栽
丛生芽苗增殖培育几代后，转入生根培育基中培育，30 d后的培育成果显现： IBA和IAA对芽苗生根都有影响，IBA的影响﹥IAA，其间，在添加02 mg·L-1 IBA的1/2 MS培育基上，生根率为952%，均匀生根数568条左右（图1F，G，H），显着高于其他各处理（表5）。将生根的试管苗移栽至河沙+有机肥3∶1的基质中，并坚持温室温度25 ℃，相对湿度80%有利于款冬试管苗的移栽的成活[11]，20 d后成活率达90%（图1I）。
36成长量与产值测算
4月初，将平等巨细的组培苗、培育苗及野生苗移栽与相同立地条件的实验地内，坚持维护办理技能共同，11月中旬核算测算成长量与花粒产值[1213]，。成果标明：3品种型在全株鲜重、单株花粒数、单株花重及小区均匀产值等方面都存在显着差异，其间以组培苗的各种目标都远远超出了其他2品种型（表6）。
37组培品与野生品有用成分
实验成果显现：组培样品液与对照品液在同一硅胶G薄层板上别离用29打开剂打开后，用氨水熏，均显黄色斑驳，证明组培品和野生品中均含芦丁及懈皮素。别离精细汲取各样品液及对照品液进行色谱测定，核算成果显现：组培和野生款冬花中芦丁质量分数别离为023%，025%。
4评论
款冬叶柄被白色毡毛，灭菌较为困难，灭菌时可在消毒剂的各处理中参加2滴吐温80以加快消毒剂的滋润作用。75%的乙醇一直是较好的植物资料灭菌剂，但独自运用时作用并不抱负，因而，本次实验选用了75%的乙醇处理30 s后与01% HgCl、饱满漂白粉上清液的不同处理合作，取得了杰出的灭菌作用，其间75%乙醇30 s+饱满漂白粉上清液900 s是款冬叶柄较好的消毒实验组合，75%乙醇30 s与01%HgCl配比的各组合，尽管污染率都相对较低，但褐变率都相对较高，实验标明：漂白粉上清液对款冬外植体资料消毒作用较好，较长时刻浸泡时构成的损伤也较小。
激素品种和浓度对款冬叶柄愈伤安排诱导与植株再生具有重要作用，细胞分裂素6BA与成长素2，4D对愈伤安排的诱导具有显着影响，但6BA显着﹥2，4D；植株再生的关键在于愈伤安排是否能分解出不定芽，本实验选用了具有较强活性的细胞分裂素ZT有用促进了不定芽的分解。
增殖培育阶段，KT与IBA对芽苗的增殖都有较显着的影响，但KT显着﹥IBA，且当浓度较高时会呈现玻璃化[14]。IBA较高时基部会呈现愈伤安排。
生根过程中，款冬茎段基部较易构成愈伤安排，不利于新根发生也影响移栽成活率，可恰当添加光照和下降培育温度以削减愈伤安排的构成[8]。一起，培育基中营养元素浓度较高时，试管苗发生依赖性而不易生根[15]，下降培育基中的糖浓度，可促进根原基的构成[16]，实验中发现选用1/2MS+IBA 02 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1，生根率可达952%，且成长强健。选用河沙+有机肥3∶1基质，可进步试管苗的移栽成活率。
大田培育試验阶段，组培株在全株鲜重、单株花粒数、单株花重及小区均匀产值等方面都远远超过了培育株与野生株，而且组内标准差较小，成长规整，尽管与培育株在均匀粒重上差异不显着，但由于培育过程中激素的运用而增强了花芽分解，花粒数的显着进步以致使产值进步显着。
测定成果标明，组培和野生款冬花在有用成分及含量上根本共同，彻底可以替代野生品入药，但其培育产值远远大于野生种，因而，以组培快繁途径解救野生款冬资源，树立工厂化、规模化的款冬花出产基地是切实可行的。
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[责任编辑吕冬梅]endprint