体内有哪几种血管 蒙花苷与木犀草素联用对离体血管的舒张效果及其机制研讨
杨耀 陈波 梁凯伦 苏洁 陈素红 吕圭源
[摘要] 为研讨蒙花苷与木犀草素联用对SD大鼠离体血管环的舒张效果及其效果机制。选用离体血管环张力试验调查蒙花苷单用（7.5×10-6 g·mL-1）、木犀草素单用（7.5×10-6 g·mL-1）、蒙花苷与木犀草素联用（1∶4）对去甲肾上腺素引起的SD大鼠完好、去内皮、LNAME及吲哚美辛预处理胸主动脉缩短的影响；Western blot检测胸主动脉pAkt，peNOS等蛋白水平。试验成果显现，蒙花苷与木犀草素联用对完好、去内皮及LNAME预处理的血管环舒张率高于两者单用；且两者联用能显着促进血管中pAkt，peNOS蛋白表达。试验成果说明蒙花苷与木犀草素联用能有用舒张血管，其机制可能是经过激活PI3K/Akt/NO信号通路，增强eNOS活性，然后添加NO的组成与开释，到达舒张血管的效果。
[关键词] 蒙花苷； 木犀草素； 联用； 血管舒张； 机制； 高血压
Relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on isolated
vessels in vivo and its mechanism
YANG Yao1， CHEN Bo1， LIANG Kailun1， SU Jie1， CHEN Suhong2*， LV Guiyuan1*
（1.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；
2.Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310053， China）
[Abstract] To study the relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on aortic rings in SD rats and its mechanism. The effect of buddleoside alone（7.5×10-6g·mL-1）， luteolin alone（7.5×10-6g·mL-1） and the combination of buddleoside and luteolin（1∶4） on norepinephrineinduced contractility of complete， endotheliumdenuded， and LNAME and indomethacinpretreated thoracic aorta in SD rats were observed in the in vitro ring tension test. Western blot was used to detect pAkt and peNOS protein expressions in the thoracic aorta. The experimental results showed that buddleoside combined with luteolin could significantly increase the relaxation rate of blood vessels and endothelium and LNAMEpretreated vascular rings compared with the two single administrations. And buddleoside combined with luteolin could also significantly increase pAkt and peNOS protein expressions.The results suggested that the combination of buddleoside and luteolin could effectively relax the blood vessel， and the mechanism may be to increase the synthesis and release of NO and reach the role of relaxing blood vessel by activating PI3K/Akt/NO signaling pathway and enhancing the activity of eNOS.
[Key words] buddleoside； luteolin； combination； vasorelaxation； mechanism； hypertension
高血壓病是以动脉血压增高为首要临床表现，是严重危害人类健康的常见病；绝大多数高血压患者均有不同程度的血管内皮功用障碍，而血管内皮结构和功用的改动又会促进高血压的开展[1]。高血压的发病机制与神经内排泄免疫网络密切相关，是全体调理一起效果的成果；中医药具有多成分、多靶点优势，能有用改进血管内皮功用，舒张血管到达降压的效果[2]。
野菊花是菊科植物菊花Chrysanthemum indicum的枯燥头状花序，是一种常用的医治高血压中药[3]；植物化学研讨标明，菊花富含木犀草素和蒙花苷等多种黄酮类化合物，且木犀草素和蒙花苷被认为是其最重要的降压活性成分[4]。木犀草素（luteolin，LUT）是一种常见的黄酮类化合物，存在于许多类型的植物中，且已被用于我国传统医学医治多种疾病，如高血压、炎症性疾病和癌症等[58]。蒙花苷（buddleoside，BUD）是中药野菊花中首要的活性化合物，具有抗炎、镇痛、发汗、降血压、抗应激、焦虑、解热等活性[9]。已有研讨标明木犀草素血管舒张效果的结构活性联系[10]；而蒙花苷关于血管损害的维护研讨甚少。本课题组前期研讨标明，蒙花苷与木犀草素联用关于自发性高血压模型大鼠（SHR）的高血压医治有显着的联用增效效果，能显着下降SHR大鼠的缩短压与舒张压，下降SHR大鼠血清中内皮素（endothelin，ET）的开释和添加血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的水平[11]，提示其效果机制可能与舒张血管相关。因而，本文选用离体大鼠胸主动脉环模型，调查研讨木犀草素、蒙花苷及其联用的舒张血管效果及其机制。
1 资料
1.1 动物 SD大鼠24只，雄性，体重220～400 g，由浙江省试验动物中心供给，许可证号SCXK（浙）20140001。
1.2 试剂 蒙花苷（76.01%，试验室克己）；木犀草素（98%，南京泽朗）；重酒石酸去甲肾上腺素打针液（NE，批号130803，上海禾丰制药有限公司）；氯化乙酰胆碱（Ach，≥98.0%，上海信帆生物科技有限公司）；戊巴比妥钠（Sigma分装，批号WS20130112，上海西唐科技有限公司）；吲哚美辛（indomethacin）、左旋硝基精氨酸甲酯（Lnitro arginine methyl ester，LNAME）均购自美国Sigma公司。RIPA蛋白裂解液、ECL化学发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研讨所）；磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抗体（pAkt，CST公司），磷酸化一氧化氮合酶抗体（peNOS，CST公司），GAPDH抗体（Santa Cruz公司）；氯化钠（NaCl）、氯化钙（CaCl2）、氯化钾（KCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、硫酸镁（MgSO4）、碳酸氢钠（NaHCO3）以及葡萄糖（Glucose）均为国产剖析纯化学试剂。
1.3 仪器 离体血管灌流试验体系（上海奥尔科特生物科技有限公司）；张力换能器（上海奥尔科特生物科技有限公司）；ALCMPA2000m生物信号收集处理体系（上海奥尔科特生物科技有限公司）；电热恒温水槽（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Powerwave340酶标仪（美国BIOTEK）；MICROCL17微量离心机（美国Thermo）；化学发光成像仪（MiniChemiⅡ，北京赛智创业科技有限公司）。
2 办法
2.1 KrebsHenseleit solution液（KH液）制造 A液：MgSO41.2 mmol·L-1；B液：CaCl21.8 mmol·L-1，NaCl 118.1 mmol·L-1；C液：KCl 4.7 mmol·L-1，NaHCO325 mmol·L-1，KH2PO41.63 mmol·L-1；glucose 10.0 mmol·L-1。取A，B母液各50 mL，C母液100 mL，葡萄糖2 g，加去离子水定容到1 000 mL，用pH计和HCl调至pH 7.4，现配现用（新鲜制造，每只大鼠约需500 mL）。
2.2 离体主动脉环的制备 大鼠腹腔打针3%戊巴比妥钠50 mg·kg-1麻醉，剪开胸腔，敏捷游离胸主动脉，置于KH液中漂洗。当心剪除血管周围的脂肪和结缔安排，将主动脉剪成3～5 mm的血管环。依据试验需求，选用机械法，用棉签冲突血管环内外表去除内皮细胞，将部分血管环制备成去内皮的模型。
2.3 离体主动脉环固定 将血管环悬挂于经37 ℃预热，容量为10 mL的浴槽内，一端固定，一端经过张力换能器衔接生物信号收集体系，在继续通和95% O25%CO2混合气体的状态下，逐步调理其根底张力至2 g，并在37 ℃下安稳60 min，其间每15 min换液1次。用1 μmol·L-1NE缩短血管环达峰值，参加浓度为10 μmol·L-1Ach，经过血管舒张的程度查验血管內皮完好性。以1 μmol·L-1NE诱发最大缩短起伏为100%，以参加舒张药物后的血管张力改变起伏与NE诱发最大缩短起伏之间的比率反映血管张力的改变。
2.4 BUD，LUT和两者联用对血管环的舒张效果 取内皮完好或去内皮的血管环，分为对照组、BUD单用组（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT单用组（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT联用组（1∶4）；各组药物预先孵育15 min后，参加1 μmol·L-1NE缩短血管环，调查不同受试药对血管的舒张效果；对照组以等量KH液替代受试药参加。试验完毕后，将各组血管环敏捷取下，保存于液氮中。
2.5 BUD，LUT和两者联用对不同拮抗剂预处理的血管环的舒张功用的影响 取内皮完好血管环，血管环安稳后，分为对照组、BUD单用组（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT单用组（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT联用组（1∶4）；别离以 0.1 mmol·L-1LNAME预处理血管环15 min或10 μmol·L-1吲哚美辛预处理血管环20 min；再参加相应的药物与血管环共孵育15 min，最终参加1 μmol·L-1NE缩短血管环，调查不同受试药对血管的舒张效果；对照组以等量KH液替代受试药参加。试验完毕后，将各组血管环敏捷取下，保存于液氮中。
2.6 BUD，LUT和两者联用维护离体大鼠血管环pAkt，peNOS蛋白表达 取上述各试验保存的离体大鼠血管环安排，经液氮研磨后，参加RIPA蛋白裂解液，提取安排蛋白，然后用BCA蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经8%～10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）别离后，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%的脱脂奶粉溶液，在摇床上室温关闭2 h，参加不同一抗：pAkt（1∶1 000），peNOS（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PBST洗刷3次，参加相应二抗，室温下孵育1 h，PBST洗刷3次。反响信号经ECL化学发光液检测，成果MiniChemi Ⅱ凝胶成像仪收集图画，剖析成果。
2.7 计算处理 试验数据用±s标明，选用SPSS 16.0软件进行计算学剖析，计算学办法为单因素方差剖析（Oneway ANOVA）并做多重比较（LSD法），P<0.05为有计算学含义。
3 成果
3.1 BUD，LUT和两者联用对内皮完好和去内皮血管环的舒张效果 在内皮完好血管环上，BUD和LUT单用及两者联用均可显着舒张NE引起的血管缩短，且联用舒张率更大（P<0.05或P<0.01）；在去内皮血管环上，除BUD单用外，LUT单用及两者联用同样地均可显着舒张NE引起的血管缩短，且联用舒张率更大（P<0.01）；与内皮完好血管环比较，在去内皮血管环上，BUD，LUT单用及两者联用的舒张率均减小，但仅BUD单用引起的舒张率具有计算学差异（P<0.01），见图1。
3.2 BUD，LUT和两者联用对LNAME预处理血管环舒张效果的影响 LNAME预处理血管环后，LUT单用和两者联用能显着舒张NE引起的血管缩短，且联用舒张率更大（P<0.01）；与未经LNAME预处理的血管环比较，BUD，LUT和两者联用对LNAME预处理的血管环的舒张率均显着下降（P<0.01），见图2。
3.3 BUD，LUT和两者联用对吲哚美辛预处理血管环舒张效果的影响 吲哚美辛预处理血管环后，LUT单用和两者联用能显着舒张NE引起的血管缩短，且联用舒张率更大（P<0.01）；与未经吲哚美辛预处理的血管环比较，BUD，LUT单用和两者联用对吲哚美辛预处理的血管环的舒张率无计算学差异，见图3。
3.4 BUD，LUT和两者联用对离体大鼠血管环pAkt，peNOS蛋白表达的影响 BUD，LUT单用及两者联用能显着添加完好血管环和去内皮血管环安排中的pAkt，peNOS蛋白水平，且联用效果更好；LNAME预处理的血管环后，血管环安排中pAkt，peNOS蛋白水平显着下降，BUD，LUT单用及两者联用能不同程度添加LNAME预处理血管环安排中pAkt，peNOS蛋白水平的表达，且联用效果更好。而BUD，LUT单用及两者联用对经吲哚美辛预处理的血管环安排中pAkt，peNOS蛋白水平的表达无显着影响，见图4。
4 评论
近年来，经过动物试验及体外细胞研讨标明，多种中药及有用成分可经过降血脂、抗氧化损害、调理内皮细胞活性物质排泄、抗细胞凋亡等到达维护血管内皮功用的意图[12]。中药医治血管内皮功用障碍相关性疾病具有取得便利、价格低廉、简单被人们承受的共同优势。尽管中药抗血管内皮损害的部分效果机制研讨已有报导，但中药复方、提取物的多靶点效果途径仍需注重，很多研讨仅触及内皮细胞的各种排泄因子在中药药理效果下的改变，却未能说明其调理的环节和方法。因而，研讨具有血管内皮细胞维护效果的中药及中药复方药物对心血管疾病的防治研讨具有重要含义。
高血压、动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛等多种心血管疾病状态下的血管内皮功用障碍的首要原因有eNOS组成/活性的下降，NO生成的削减；血管活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过量发生，O2-与NO反响生成ONOO-，导致NO的生物利费用下降；以及脂质过氧化和抗氧化才能的下降[13]。ET和NO平衡失调是内皮功用障碍的首要原因之一。NO是一种高度活泼的自由基，并具有舒张血管的功用，它以左旋精氨酸（LArg）为底物，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化生成[14]。血管内皮上的NO/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）体系在调理血管舒缩功用中发挥着重要效果[15]。PI3K/Akt信号通路的活化能促进内皮细胞的存活和血管生成[16]。蛋白激酶Akt是一种调理细胞存活、成长和糖代谢的多功用调理器；就其心血管功用，Akt激活下流血管成长因子血管内皮成长因子（VEGF）和促血管重生蛋白因子使内皮细胞存活和保证血管生成[1718]。除此之外，Akt还具有磷酸化eNOS丝氨酸1179或1177位點的才能，诱导内皮细胞NO的生成，然后操控血管舒缩功用[19]。
木犀草素具有广泛的生物活性和药理效果[2023]。已有研讨标明木犀草素维护大鼠心脏安排缺血再灌注损害经过按捺诱导型一氧化氮合酶表达，下降NO的发生，然后阻挠NO与超氧阴离子自由基的效果，然后避免氧化损害[24]。还有研讨发现木犀草素维护缺血再灌注诱导的心肌细胞损害是经过改进心肌缩短功用，按捺氧化应激，以及激活PI3K/Akt信号通路[25]。且本试验室前期研讨标明，蒙花苷与木犀草素联用关于自发性高血压模型大鼠的高血压医治有显着的联用增效效果，能下降SHR大鼠血浆中ET的开释和添加NO水平[11]。
本试验选用离体血管环模型，研讨发现BUD与LUT联用能舒张NE引起的血管缩短，对完好及去内皮的离体血管环的舒张率均高于BUD和LUT单用组，且去内皮血管环的舒张率低于完好血管环；经LNAME预处理，按捺血管环内皮eNOS的活性后，血管环的舒张率均显着低于完好血管环，BUD与LUT联用能显着升高LNAME预处理后的血管环的舒张率，且显着高于BUD和LUT的单用；而经吲哚美辛预处理，按捺血管环内皮环氧合酶2的活性后，血管环的舒张率与完好血管环的舒张率比较，无显着差异；且BUD，LUT单用及联用引起的血管环舒张率与完好血管环的舒张率比较，无显着差异。Western blot成果显现经去内皮、LNAME预处理后，peNOS的表达显着低于完好血管环；经吲哚美辛预处理后，peNOS的表达与完好血管环比较无显着差异。BUD与LUT联用均能促进各组血管环中pAkt，peNOS蛋白水平的表达，并显着优于BUD及LUT单用。上述成果提示BUD与LUT联用舒张血管的方法是内皮依赖性舒张效果，且可能是经过增强血管内皮eNOS的活性，然后舒张NE引起的血管缩短。
综上所述，BUD与LUT联用舒张血管的效果机制可能是经过PI3K/Akt/NO信号通路，促进eNOS磷酸化而激活eNOS的活性，然后添加内皮NO的组成与开释，到达舒张血管的效果。此外，该研讨关于解说中药配方的强壮优势，相关于单味药的使用，多味药联合使用发生的更牢靠和更强壮的效果具有重要的含义。
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[责任编辑 张宁宁]