小鼠模型 PSGL—1+/—；IL—2—/—小鼠模型的构建
杨扬等
[摘要] 意图 构建PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。 办法 将白介素2敲除（IL-2 KO）小鼠与P-挑选素糖蛋白配体-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠杂交，剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。 成果 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后，PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型构建成功。 定论 将IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交三代后，成功树立了PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。
[关键词] P-挑选素糖蛋白配体-1；白介素-2；P-挑选素糖蛋白配体-1敲除小鼠；白介素-2敲除小鼠；动物模型
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）23-0007-03
[Abstract] Objective To construct the PSGL-1+/-；IL-2-/- mice model. Methods PSGL-1 KO mice were mated with IL-2 KO mice. Mice were genotyped by PCR after cut the tail and extracted DNA. Results After PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice for three generations， PSGL-1+/-；IL-2-/- mice were obtained. Conclusion PSGL-1+/-；IL-2-/- mice are established through PSGL-1 KO mice being mated with IL-2 KO mice.
[Key words] PSGL-1；IL-2；PSGL-1 knockout mice；IL-2 knockout mice；Animal model
基因工程小鼠（genetically engineered mouse，GEM）是跟着细胞工程、分子生物学的开展，使用基因打靶、转基因、嵌合体等技能对试验小鼠基因组有意图的改造或润饰，使小鼠有特定的特性或生物表型，以研讨基因的功用、调控机制及与其他基因的相互效果等[1]。基因工程小鼠还能够作为人类的疾病模型，如自发肿瘤模型、自发动脉粥样硬化模型等，研讨疾病的发病机制和药物研讨。基因工程小鼠包含基因敲除小鼠、基因替换小鼠和转基因小鼠[2，3]。本试验所用的两种基因工程小鼠为基因敲除小鼠，分别是白细胞介素-2敲除小鼠（IL-2 KO mouse）和P-挑选素糖蛋白配体-1敲除小鼠（PSGL-1 KO mouse）。为了进一步研讨白细胞介素-2和P-挑选素糖蛋白配体-1在炎症、汗水管及肿瘤疾病中的一起效果，将IL-2 KO 小鼠和PSGL-1 KO 小鼠杂交树立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型。能够再使用此小鼠模型树立各种炎症、汗水管及肿瘤等疾病模型，所以此模型可作为研讨PSGL-1和IL-2在炎症、汗水管和肿瘤中效果及相互关系的杰出动物模型。
1 资料与办法
1.1 资料来历
1.1.1 试验动物及养殖 P-挑选素糖蛋白配体-1敲除小鼠（PSGL-1 KO小鼠）和白介素-2敲除小鼠（IL-2 KO小鼠）购自美国Jackson试验室，共4只，男女各2只，周龄6～8周。小鼠在SPF级环境中养殖，动物房温度控制在22℃～28℃，湿度为50%～70%，并且坚持12 h明/12 h暗。小鼠的饲料购自广东省医学试验动物中心并经60Co辐照灭菌的全养分饲料。饮用水高压灭菌。试验设计时刻为2013年6月～2014年3月。
1.1.2 试剂 PCR引物由广州英骏公司组成，蛋白酶K及dNTP购自Sigma公司，Taq酶、Tris饱满酚及氯仿从广州康龙公司订货。
1.2 办法
1.2.1 IL-2基因的判定 突变型IL-2引物的序列：TCG AAT TCG CCA ATG ACA AGA CGC T；野生型IL-2引物的序列：CTA GGC CAC AGA ATT GAA AGA TCT；通用引物序列：GTA GGT GGA AAT TCT AGC ATC ATC C。PCR反响条件：94℃变性3 min，94℃ 30 s，64℃ 45 s，72℃ 45 s，35个循环，72℃2 min充沛延伸。在500 bp处有一条带为IL-2纯合子的小鼠，在342 bp处有一条带为野生型小鼠，在500 bp和324 bp处各有一条带为杂合子小鼠。
1.2.2 PSGL-1基因的判定 野生型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-TCAAAA TC GTCATCCCCAAC -3，P2：5'-AGCTTCCTT GTGCTGCTGAC -3''；突变型PSGL-1基因引物序列：P1：5'-CCTT CTAT CGCC TTCT TGA CG-3'，P2：5'-TCAAAA TCGTCA TCCCCAAC-3'。PCR反响的条件：94℃变性5 min，94℃30 s，65℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次；72℃延伸2 min。PSGL-1基因敲除的纯合子小鼠在500 bp处有一条带，PSGL-1基因为杂合子的小鼠在140 bp和500 bp处各有一条带。
1.2.3 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型的构建 用IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠杂交，第一代小鼠PSGL-1和IL-2基因均为杂合子，用PSGL-1+/-；IL-2+/-雄性小鼠与IL-2 KO雌性小鼠或许用PSGL-1+/-；IL-2+/-雌性小鼠与IL-2 KO雄性小鼠再进行杂交，在第二代可得到PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠。endprint
2 成果
2.1 IL-2 KO小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交状况
IL-2 KO 雄性小鼠与PSGL-1 KO雌性小鼠以1∶2的份额杂交两笼，所生小鼠IL-2和PSGL-1基因悉数为杂合子，共取得24只。用第一代小鼠与IL-2 KO 小鼠杂交，第二代共取得小鼠136只，其间PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠38只。
2.2 PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的判定成果
把PSGL-1 KO小鼠和IL-2 KO小鼠杂交，在第三代小鼠中，1、3号和4号小鼠为PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠，2号小鼠为PSGL-1+/-；IL-2+/-小鼠。图1A中的5号小鼠为PSGL-1基因的阳性对照，图1B中的5号小鼠为IL-2基因的阳性对照。
3评论
白介素-2（IL-2）是由Morgan等在1976年发现的由T淋巴细胞排泄的一种因子，主要由活化的Ⅰ型辅佐淋巴细胞排泄，主要功用是影响T细胞的增生，促进T细胞的增殖；还促进NK细胞和B细胞的活化、增殖；促进细胞毒性T淋巴细胞的发生和增殖等[4-6]。白介素-2还能够促进NK细胞、T淋巴细胞发生肿瘤坏死因子和干扰素等，并且现在已广泛应用于抗炎和抗肿瘤医治[7-10]。
P-挑选素糖蛋白配体-1（P-selectin glycoprotein ligand-1， PSGL-1）是一种粘附分子，在简直一切类型的白细胞外表表达，是挑选素的配体[11-14]。因而，PSGL-1与表达于白细胞的L-挑选素及表达于活化的血管内皮细胞的E-挑选素和P-挑选素相互效果，然后介导白细胞的黏附[15，16]。因为白细胞黏附与炎症、凝血、创伤修正及肿瘤搬运等密切相关，因而PSGL-1介导的白细胞黏附效果可在多种生理和病理过程中发挥重要的效果。
IL-2敲除小鼠是由Ivan Horak等在1991年构建成功的，IL-2纯合子敲除小鼠在4～9周时会呈现脾、淋巴结肿大、肠道炎症及贫血等疾病的症状。因为白介素-2与PSGL-1在炎症、肿瘤等疾病中都发挥重要效果，为了探究两者是否具有协同或拮抗效果，本试验将白细胞介素-2敲除小鼠和黏附分子P-挑选素糖蛋白配体基因敲除小鼠杂交树立了PSGL-1基因敲除及IL-2为杂合子的PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠模型，在养殖的过程中，因为PSGL-1+/-；IL-2-/-小鼠的免疫力会下降，易感染，因而在养殖的过程中对无菌的要求会愈加严厉，小鼠有必要养殖于SPF环境中，饮用水及饲料有必要是无菌的。能够使用此小鼠模型树立各种炎症、汗水管、本身免疫性疾病及肿瘤模型，也为研讨PSGL-1和IL-2在炎症、汗水管和肿瘤疾病中的效果及相互关系供给了杰出的动物模型。
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