油脂随同物 根据“随同标志物”在线操控技能的绞股蓝总皂苷纯化工艺及成分判定研讨
范冬冬 匡艳辉 董利华 叶潇 陈两绵 张东 马振山 王锦玉 朱晶晶 王智民 王德勤 李楚源
[摘要] 依据“随同标志物”紫外在线检测技能以绞股蓝总皂苷（GPS）为方针，优化绞股蓝中GPS的纯化工艺，选用UPLCQTOFMS技能对GPS进行定性。“随同标志物”紫外在线检测研讨标明，上样结尾为流出液吸光度为原药液的1/2时，洗脱结尾为洗脱流出液吸光度根本安稳。UPLCQTOFMS断定出GPS提取物中的16个皂苷，其间新皂苷3个。该研讨优选出的纯化工艺简略、检测便利、易于在线测定、实时记载，能较好的运用到大出产或出产的自动化中。质谱定性断定成果标明，依据“随同标志物”紫外在线检测技能能很好地保存药材中的首要药效成分，为进程操控和质量溯源供给了剖析东西。
[关键词] 绞股蓝总皂苷； 纯化； 大孔吸附树脂； 随同标志物； 在线检测； UPLCQTOFMS
Purifying process of gynostemma pentaphyllum saponins based on
"adjoint marker" online control technology and identification of
their compositions by UPLCQTOFMS
FAN Dongdong1，2， KUANG Yanhui3， DONG Lihua 2， YE Xiao 1，2， CHEN Liangmian2， ZHANG Dong 2，
MA Zhenshan2， WANG Jinyu2， ZHU Jingjing2*， WANG Zhimin2*， WANG Deqin3， LI Chuyuan3
（1. Shaanxi University of Chinese Medicine， Xi′an 712046， China；
2. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Institute of
Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
3. Hutchison Whampoa Guangzhou Baiyunshan Chinese Medicine Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China）
[Abstract] To optimize the purification process of gynostemma pentaphyllum saponins （GPS） based on "adjoint marker" online control technology with GPS as the testing index. UPLCQTOFMS technology was used for qualitative analysis. "Adjoint marker" online control results showed that the end point of load sample was that the UV absorbance of effluent liquid was equal to half of that of load sample solution， and the absorbance was basically stable when the end point was stable. In UPLCQTOFMS qualitative analysis， 16 saponins were identified from GPS， including 13 known gynostemma saponins and 3 new saponins. This optimized method was proved to be simple， scientific， reasonable， easy for online determination， realtime record， and can be better applied to the mass production and automation of production. The results of qualitative analysis indicated that the "adjoint marker" online control technology can well retain main efficacy components of medicinal materials， and provide analysis tools for the process control and quality traceability.
[Key words] gynostemma pentaphyllum saponins （GPS）； purification； macroporous absorptive resin； adjoint marker； online detecting； UPLCQTOFMS
絞股蓝Gynostemma pentaphyllum （Thumb.） Makino为葫芦科多年生草质藤本植物，有“南边人参”和“第二人参”的美誉，别号小苦药、公罗锅底、五叶藤、遍地生根，在日本民间称“甘茶蔓”[12]。早在我国明代《救荒本草》中已有记载，绞股蓝性寒味甘，具有清热解毒、补气生津、祛痰止咳、安神固精之功。绞股蓝中首要活性成分为达玛烷型皂苷类成分，且含量较高；它具有维护心脑血管、抗肿瘤、增强免疫、降血糖、调血脂、保肝、抗氧化、抗溃疡以及抗衰老等多种活性[3]。
绞股蓝药材种类来历较为紊乱，不同产地同一种类、不同栽培种类、不同药用部位等，其皂苷含量及成分都存在很大差异，也许是迄今药典没有法定规范的难点地点。据悉绞股蓝皂苷（GPS）提取物质料出产商运用的是根，而部颁规范WS3Z00693（Z）指定运用部位為全草；全草和根的成分存在很大差异，加上缺少对照品，致使许多企业难以复制出其出产工艺。
纯化皂苷的工业化惯例手法是大孔吸附树脂法，实践出产中往往首要依靠经历的结尾放行形式，或辅佐旁线或离线手法（TLC法和分光光度法测定皂苷），加上对GPS的含量要求较高（要求“总皂苷≥80%”），实践出产中往往难以完成不间断出产，乃至不得不重复纯化，这样又或许导致其次生皂苷成分的生成而致成分更杂乱，出产的重复性和质量的均一性很难确保，一起也难以完成出产的自动化和接连化。为处理该问题，以洗脱液的旁线检测（TLC检测成分、UVVIS测定皂苷和含固量的测定）为目标为指示，规划并树立洗脱液中“随同标志物”（有UV吸收者）与皂苷（无UV吸收）间的联系，并以随同标志物的吸光度作为快速判别进程监测和结尾放行的目标，完成对皂苷类成分在纯化进程的“代替”在线操控和实时监测。
本研讨以绞股蓝皂苷为目标，依据“随同标志物”的紫外在线检测，完成对无紫外吸收皂苷的进程操控，为工业化接连出产供给了一种简略易行、精确牢靠的检测技能；一起对纯化得到的GPS进行主成分定性剖析，以保证质料与制品间质量的可溯源性。
1 资料
梅特勒精细电子天平（XS105DU）；紫外可见分光光度计（T6新世纪）；N1100型EYELA旋转蒸腾仪（上海安亭科学仪器制作）；SB1100 EYELA水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；SHZD（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）；TGL16G台式离心机（上海安亭科学仪器制作）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Xevo G2S QTOF质谱仪（美国Waters公司）；配有Lockspray 接口，电喷雾离子源（ESI），MassLynx4.1质谱工作站；ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱（Waters公司）。
绞股蓝皂苷XLIX对照品（纯度≥98.0%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；甲醇、乙醇、冰乙酸、高氯酸（剖析纯）、石油醚（剖析纯）、Fisher 乙腈、甲酸（质谱纯）、5%香草醛冰乙酸溶液；HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500，NKAⅡ大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工）；SP825L（北京绿百草）；绞股蓝为葫芦科植物绞股蓝的枯燥地上部分，试验用样品为福建漳州绞股蓝的叶子，种类断定经叶华谷研讨员断定为绞股蓝G. pentaphyllum。
2 办法与成果
2.1 绞股蓝总皂苷的测定
2.1.1 对照品溶液的制备
精细称取绞股蓝皂苷XLIX对照品10.00 mg于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为2.00 g·L-1的溶液。
2.1.2 供试品溶液的制备
精细称取绞股蓝总皂苷10.00 mg，置2 mL离心管中，加石油醚2 mL，超声处理10 min，6 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，残渣挥干，加甲醇分次溶解，搬运至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取部分6 000 r·min-1离心10 min，得供试品。
2.1.3 规范曲线的制作
精细汲取绞股蓝皂苷XLIX对照品溶液（2.00 g·L-1）10，20，40，60，80，100 μL别离置15 mL具塞试管中，挥干，精细参加新制造的5%香草醛冰乙酸溶液与高氯酸（2∶8）的混合液2 mL，摇匀，密塞，置60 ℃水浴中加热15 min，当即放入冷水中冷却至室温，别离精细加冰乙酸10 mL，摇匀，以试剂作空白，依照紫外可见分光光度法（《我国药典》2010年版一部附录VA）试验，在550 nm的波利益测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、以质量（X）为横坐标，制作规范曲线，得规范曲线方程Y=1.088 4X-0.003 3，r=0.999。成果标明，取样量在0.01～0.20 mg 有杰出的线性联系。
2.1.4 绞股蓝总皂苷含量测定办法
精细量取供试品200 μL置15 mL具塞试管中，挥干甲醇后按2.1.3项下操作，测定吸光度，用规范曲线核算出绞股蓝总皂苷的质量。
2.2 大孔吸附树脂类型挑选
2.2.1 大孔吸附树脂静态吸赞同解吸试验调查
2.2.1.1 大孔吸附树脂预处理 7种不同类型大孔吸附树脂（HPD100HPD500，SP825L，NKAⅡ）别离用95%乙醇浸泡24 h，充沛溶胀，用乙醇洗至溶液加适量蒸馏水无白色污浊现象时停止，终究用去离子水洗至无醇味，备用。
2.2.1.2 静态吸赞同解吸 30%乙醇回流提取2次，料液比为1∶8，每次提取1.5 h，兼并提取液，减压浓缩至生药含量0.1 g·mL-1即为提取液。称取各类型经预处理的树脂5 g（湿质量）置于100 mL锥形瓶中，各参加绞股蓝提取液50 mL，继续振摇30 min，静置12 h后，抽滤，得吸附后的滤液。将吸附后的各类型树脂滤出后别离另置100 mL锥形瓶中，各参加95%乙醇50 mL，其他操作同上，得解吸后的滤液。精细量取吸附后的滤液100 μL、质料液30 μL宽和吸后的滤液50 μL置15 mL具塞试管中，挥干后按2.1.3项下操作，测定吸光度，由规范曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量。单位树脂饱满吸附量=（质料液总皂苷质量-吸附后滤液总皂苷质量）/湿树脂的量；解吸率=解吸后的滤液总皂苷质量/饱满吸附量×100%。依据以上公式核算每种树脂对总皂苷的静态饱满吸附量及解吸率（质料液总皂苷质量为244.78 mg），成果见表1。
由表1可见，HPD系列树脂的饱满吸附量及解吸率都优于其他2种类型树脂（SP825L，NKAⅡ），归纳吸附及解吸2方面要素考虑，能够以为HPD系列树脂对绞股蓝总皂苷具有较好的吸附及解吸才干，因而选用HPD系列树脂来进行下一步调查。
2.2.2 HPD系列树脂对绞股蓝总皂苷的吸附
取绞股蓝提取液6份，每份120 mL，1份蒸干得绞股蓝提取物，称重；别的5份别离经过预先处理好的HPD100，HPD200，HPD300，HPD400，HPD500型大孔吸附树脂柱，静置过夜，再别离以2倍柱体积去离子水和3倍柱体积95%乙醇洗脱，95%乙醇洗脱液浓缩，枯燥、收粉，得绞股蓝总皂苷，称重。同2.1.2的操作，在同一条件下丈量吸光度，由规范曲线方程求得绞股蓝总皂苷含量，见表2。
从表2能够看出，HPD系列大孔吸附树脂对绞股蓝提取液有很好的吸赞同纯化作用。归纳考虑几种树脂的吸赞同解吸附才干，终究选用HPD500大孔吸附树脂进行绞股蓝总皂苷的纯化。
2.3 HPD500树脂对总皂苷纯化工艺的调查
2.3.1 “随同标志物”紫外吸收与总皂苷的联系
取生药量为 0.1 g·mL-1的提取液以3倍柱体积每小时的流速上样，经过树脂柱进行吸附，吸附饱满后，静置12 h，然后别离用10倍柱体积去离子水洗脱，再别离用10倍柱体积10%乙醇、7倍柱体积15%乙醇、8倍柱体积20%乙醇和10倍柱体积70%乙醇洗脱，每个柱体积为1个流分，搜集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接进行紫外检测，然后核算每一个流分的总皂苷含量，树立每个流分的紫外吸收值与总皂苷含量之间的相关性，成果见图1。
由上图及数据可得，“随同标志物”紫外吸收与总皂苷含量有正相關性，所以能够经过检测“随同标志物”的紫外吸收来监测绞股蓝总皂苷的含量改变。
2.3.2 上样量的调查
2.3.2.1 最大吸收波长的断定 对浓缩处理好的质料液在600～800 nm波长下扫描。样品在665 nm处有最大吸收，所以挑选检测波长为665 nm。
2.3.2.2 上样量在线检测 惯例办法一般选用每次测定流出液中皂苷含量来判别走漏率，此操作繁琐且出成果时刻较长。因而考虑把走漏率与流出液的“绞股蓝皂苷随同物”（简称随同物）紫外吸收相关起来，然后经过测定出口洗脱液的“随同物”紫外吸收来判别上样结尾，此办法简略、便利、可行。
用途理好的HPD500树脂装柱，取生药量为 0.1 g·mL-1的提取液测定样品上样液的紫外吸光度，以3倍柱体积每小时的流速不断上样，以1倍柱体积为1个流分，取其一半蒸干，核算各自的含固量及总皂苷含量，并核算走漏率，取另一半流分直接进行紫外检测，树立各流分的总皂苷走漏率与“随同物”紫外吸收间的相关性，断定最大上样量，成果见图2，完成经过紫外吸收值来判别上样结尾的意图。
图中接连调查了1～32倍柱体积的上样量，别离核算了各流分中绞股蓝总苷走漏率和相应的紫外吸光度。当上样量为21倍柱体积时，流出液中绞股蓝皂苷走漏率92.90%；流出液的吸光度0.172，质料液吸光度0.328；当上样量为22倍柱体积时，洗脱液的绞股蓝皂苷走漏率为102.34%，对应的吸光度为0.178，因而当绞股蓝皂苷达100%走漏时，洗脱液的“随同物”紫外吸光度接近于质料液紫外吸光度的1/2。由此主张，当出口洗脱液与上样质料液紫外吸光度比值为1∶2时，即断定为上样结尾。
2.3.3 洗脱梯度调查
2.3.3.1 梯度洗脱 提取液以3倍柱体积每小时的流速上样，经过树脂柱进行吸附，吸附饱满后，静置12 h，然后别离用8倍柱体积去离子水洗脱，再别离用8倍柱体积15%乙醇和8倍柱体积70%乙醇洗脱，每个柱体积为1个流分，搜集各流分，量取一半流分液蒸干，另一半流分直接进行紫外检测，然后核算每个流分的含固量及总皂苷含量，树立每个流分的紫外吸收值与含固量及总皂苷含量之间的相关性，经过紫外吸收度来判别每个梯度洗脱结尾。
2.3.3.2 最大吸收波长的断定 别离选取各梯度洗脱液1份在500～800 nm波长下扫描。本着吸光度小于1，且各梯度均有杰出的吸收，故挑选在555 nm作为检测波长。
2.3.3.3 洗脱梯度在线检测 树立每个流分的“随同物”紫外吸收、含固量及总皂苷含量联系图，成果见图3。
由图可得，当洗脱流出液吸光度根本安稳时可换下一个梯度进行洗脱，用70%乙醇洗脱时，吸光度根本安稳时就是洗脱结尾。
2.4 纯化工艺验证
用途理好的HPD500树脂20 mL装柱，取生药含量为0.1 g·mL-1的提取液上样，经过紫外检测下口流出液紫外吸收为上样液的1/2时即为上样饱满，静态吸附12 h后进行洗脱，树脂柱先别离用去离子水和15%乙醇洗脱除杂，除杂结尾为下口流出液吸光度根本安稳，然后用70%乙醇洗脱，洗脱结尾同样是流出液吸光度根本安稳且吸光度很小，搜集70%乙醇洗脱馏分减压浓缩，浓缩液减压蒸干，得绞股蓝总皂苷。同2.1.2的操作，在同一条件下丈量吸光度，由规范曲线方程求得总皂苷的纯度为84.24%，皂苷搬运率65.50%，可见经优选的工艺是可行的。
2.5 总皂苷UPLCQTOFMS定性剖析
2.5.1 供试液的制备
称取绞股蓝总皂苷3.73 mg，2 mL甲醇溶解，离心（12 000 r·min-1，10min），取上清液，即得。
2.5.2 UPLCMS条件
2.5.2.1 UPLC条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；活动相乙腈（A） 0.1%甲酸水（B），梯度洗脱（0～3 min，30%～35%A；3～8 min，35%～45%A；8～12 min，45%～60%A；12～15 min，60%～80%A）；流速0.4 mL·min-1；进样体积1 μL；柱温35 ℃；自动进样器温度20 ℃；PDA检测器扫描规划200～400 nm。
2.5.2.2 质谱条件 ESI离子源，正负离子形式扫描，毛细管电压为2 kV，锥孔电压为40 V，离子源温度120 ℃，脱溶剂气体流量600 L·h-1，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气体流量50 L·h-1，母离子磕碰能量6 eV，碎片离子磕碰能量20～50 eV，扫描规划m/z 100～2 000，扫描时刻0.2 s。
2.5.3 绞股蓝总皂苷UPLCQTOFMS定性剖析
经过对照品比对、UPLCMS碎片信息以及结合文献数据，从绞股蓝总皂苷中共指认16个化合物，其间包含13个已知和3个新皂苷，成果见表3。其总离子流图见图4。
指认的16个化合物中，其间化合物3即Gyp ⅩLⅥ是经过对照品比对得出，其他都是结合碎片信息及查阅相关文献得出。已知的13個皂苷中，其母核结构见图5，其间首要是类型I的化合物。绞股蓝皂苷不只有不同的母核结构，并且还连有不同的糖链，所以绞股蓝皂苷中存在着很多的同分异构体。经过UPLCQTOFMS定性剖析时，同一个分子离子峰会对应着不同的化合物。依据裂分规则及碎片离子信息，估测化合物6中含有3个葡萄糖、1个五碳糖和1个乙酰基，化合物10中含有3个葡萄糖和1个乙酰基，化合物14中含有2个葡萄糖和1个乙酰基，这3种化合物未见文献报导，是3个新的绞股蓝皂苷。
3 评论
大孔树脂吸附别离纯化中药是一个比较杂乱的进程，对成分有吸赞同分子筛等不同机制。关于纯化特定类别的成分到达“尽或许少地丢失拟要成分，尽或许多地去除杂质”才是最理想的状况，要完成该意图，对出产进程的实时在线监测就显得尤为重要。关于黄酮类成分，因为其本身有紫外吸收，在纯化总黄酮的进程中能够较简单使用紫外检测器完成对产品出产全进程进行在线检测和进程操控，特别是结尾放行及其规范的拟定；而该办法明显不适用于皂苷类成分（无紫外吸收），无法直接进行实时监测和在线操控；要完成对皂苷的进程操控，一般都是要对洗脱液进行取样、浓缩、化学反应、可见光检测等，才干了解洗脱液的皂苷含量状况，进而断定结尾，这样明显时刻长、操作繁琐、精确度差，无法满意产业化规划出产的需求。因而，开发适于无紫外吸收的皂苷类物质的在线快速检测办法和技能对产业化的开展具有重要的含义。本试验对“随同标志物”的紫外吸收与皂苷含量进行相关性剖析，经过检测洗脱液的紫外吸收来断定上样结尾以及洗脱进程起点与结尾，进而完成实时监测和在线操控，该技能可应用于工业化出产，具有杰出的开发远景。
绞股蓝种类繁多，不同产地绞股蓝皂苷主成分差异很大，共有成分稀疏乃至没有，这对绞股蓝药材及提取物的质量操控是一个应战。现选用UPLCQTOFMS技能能够快速、清晰的指认出绞股蓝总皂苷提取物中首要的绞股蓝皂苷，这可为绞股蓝提取物质量操控供给一种技能手法，一起还为清晰其药效物质基础供给了理论依据。
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[责任编辑 孔晶晶]