穿山甲中药 中药穿山甲的DNA分子判定研讨

尹艳+刘逊+王兵+高琳惠+张夏楠

[摘要] 对中药穿山甲及其混伪品进行分子判定研讨，树立一个安稳、精确的位点特异性PCR辨别体系。搜集整理穿山甲属动物安排样本及NCBI序列，提取基因组总DNA，PCR扩增Cytb和COⅠ序列并测序，经过BioEdit软件进行序列比对，运用MEGA 6.0构建序列体系聚类树，并根据序列特异位点规划和挑选中华穿山甲特异性辨别引物，并对PCR反响条件进行退火温度、DNA模板上样量和PCR循环数等条件的适应性查询。成果标明：Cytb和COⅠ序列均能有用对穿山甲正、伪品进行聚类剖析；在位点特异性PCR反响体系中，当退火温度为55～60 ℃，DNA模板量3～100 ng，PCR扩增35个循环时，根据COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5 能使中華穿山甲扩增出约400 bp的特异性条带，而其他穿山甲种类扩增成果为阴性。该文根据COⅠ序列的引物COⅠ-S10/A5能完成中华穿山甲与伪品印度穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲等的精确、安稳辨别。

[关键词] 穿山甲；COⅠ；Cytb；分子判定

[Abstract] The study was aimed to establish a stable，accurate site specific PCR identification system to identify Manis pentadactyla and its adulterants using DNA molecular identification. The genomic DNA was extracted from experimental samples using the DNA extraction kit. The Cytb and CO Ⅰ genes were amplified using PCR and sequenced bi-directionally. Obtained sequences were assembled using the BioEdit software. The neighbor-joining tree was constructed by MEGA 6.0. Specific identification primers were designed according to the specific allelets，and PCR reaction system was optimized. The results indicated that the Cytb and CO Ⅰ sequence both were able to be used to identify M. pentadactyla and its adulterants. With the specific primers CO Ⅰ-S10/A5，the M. pentadactyla could be amplified a 400 bp DNA band when the annealing temperature ranged from 55 to 60 ℃ and the amount of DNA template ranged from 3 to 100 ng within 35 PCR cycles. However，other adulterants displayed no relevant bands. So that primers CO Ⅰ- S10 / A5 can be used to identify the M. pentadactyla with the adulterants.

[Key words] Manis pentadactyla；COⅠ；Cytb；molecular identification

穿山甲为鲮鲤科Manidae穿山甲属Mains动物，全球现存包含散布亚洲的中华穿山甲M. pentadactyla、印度穿山甲M. crassicaudata、马来穿山甲M. javanica、菲律宾穿山甲M.culionensis 4种，散布非洲的树穿山甲M. tricuspis、大穿山甲M. gigantea南非穿山甲M.temminckii和长尾穿山甲 M. tetradactyla 4种[1]。其间中华穿山甲是我国药典规则的中药穿山甲的仅有正品来历，是我国传统贵重中药之一[3-6]，具有活血消癥、通经下乳、消肿排脓、搜风通络之成效，用于经闭症瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻痹拘挛等症。但是近年来中华穿山甲的资源极度稀缺，早在2013年国际自然维护联盟（IUCN） 物种生计委员会（SSC） 穿山甲专家组（PSG） 会议中，中华穿山甲和马来穿山甲在受胁物种赤色名录（Redlist） 中的等级就被上调为极度濒危级（Cr），而其他6 种穿山甲的等级也悉数提升为濒危级（En） [2]。穿山甲除药用之外，其肉可食且被以为味道鲜美兼具较高营养价值。穿山甲人工繁殖困难[7]，药材等来历依托野生资源捕猎且缺少科学可继续手法。根据以上原因，穿山甲野生资源逐步匮乏[8]，穿山甲商场价格贵重[9]，是以导致穿山甲不合法捕猎和私运交易众多[10-11]。

Gaudin T J等根据计算机技能对现存的7种和现已灭绝的5种穿山甲的骨骼特征进行了体系发育联系剖析，从形状学上解说了穿山甲生物地理学散布特征和物种进化史[12]。刘逊等对穿山甲产品情况及基源进行了查询和判定，并总结了系列穿山甲鳞甲的基源辨别根据[13]，但穿山甲鳞甲巨细、色彩、纹路等随源动物年纪、日子生态环境、鳞片部位等有所差异[14]，种内改变大，种间辨识度低，非经验丰富专家不能正确辨别。与之比较，DNA分子技能具有不受样品形状、数量等约束的长处，关于穿山甲这一类珍稀物种的种源判定具有共同的优势，Tobe S S等也曾提出用DNA特异性片段作为宝贵濒危物种的判定新办法[15]。现在关于穿山甲分子判定方面的研讨较少，特别缺少穿山甲属内种间分子辨别的研讨。本文运用分子符号办法对穿山甲属不同种动物进行辨别，并根据符号序列树立一个位点特异性PCR体系，以精确快速区别中华穿山甲与其他穿山甲种类。

1 资料

1.1 样品

共搜集穿山甲样品供24份（表1），其间鳞甲19份，筋膜5份。由首都医科大学中医药学院教育试验中心和江苏卫生工作技能学院刘逊副教授判定保存并奉送。

1.2 仪器

PCR仪（Applied Biosystems Veriti）；微量核酸定量仪（NanoDrop 2000C）；高档荧光化学发光体系（FUSION-SL）。

1.3 试剂

Wizard SV Genomic DNA Purification System （Promega，0000178703）；2×EasyTaq PCR SuperMix （TRANS，AS111）；2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix（KAPA，00061748）；2K DNA Marker（TRANS，E110）；Gene Green Nucleic Acid Dye（TIANGEN，P4829）。

2 办法

2.1 基因組DNA的提取、通用引物PCR扩增及测序

选用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System进行穿山甲鳞甲和筋膜的DNA提取，依照试剂盒的阐明，样品破坏后取30～50 mg 参加275 μL消化液55 ℃消化处理过夜（16～18 h），随后进行裂解，开释基因组DNA，并运用吸附柱吸附，经漂洗液去除蛋白质等杂质后，用双蒸水500 μL分2次洗脱取得基因组DNA。各样品别离用通用引物（表2）以高保真酶扩增COⅠ和Cytb序列并进行测序。PCR扩增体系为2×KAPA HiFi Hotstart ReadyMix 25 μL，正反向引物各1.5 μL，DNA 5 μL，无菌水补足至50 μL。PCR产品经过1.5%琼脂糖凝胶电泳后对意图片段切胶收回，由北京睿博兴科生物技能有限公司测序部测序，各样品均选用正反双向测序，以确保成果的精确性。

2.2 序列剖析

将测序成果运用MEGA 6.0进行比对并树立构建体系聚类树（邻接法），Bootstrap（1 000次重复）查验各分支的支持率。

2.3 特异性辨别引物的规划

将所测得的序列与GenBank中下载的穿山甲序列用BioEdit软件进行多重比对剖析，找出具有安稳差异的特异性片段，挑选取得变异位点，经过该位点运用Premier Primer 5.0软件针对中华穿山甲的特异性片段规划辨别引物，并由睿博兴科生物技能有限公司组成。

2.4 特异性辨别引物挑选

取穿山甲不同样品DNA进行位点特异性PCR，所用20 μL反响体系为：2×EasyTaq PCR Super Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，DNA经微量核酸定量仪定量并稀释至10 mg·L^-1后取1 μL，无菌水补齐。PCR产品经过添加Gene Green 核酸染料染色的1%琼脂糖凝胶电泳，紫外光下显色查询。以成果呈现特异扩增片段为阳性，无扩增为阴性，由此判别引物特异性。

2.5 特异性PCR反响条件优化

为优化位点特异性PCR反响条件，别离查询了DNA模板上样量（3，5，10，30，50，100 ng）、退火温度（55，57，60 ℃）、PCR循环数对特异性PCR成果的影响。

3 成果与剖析

3.1 根据Cytb和COⅠ序列的体系聚类树构建成果

选用MEGA 6.0剖析软件进穿山甲属动物Cytb和COⅠ序列体系聚类树的构建（图1，2）。亚洲产区与非洲产区的穿山甲别离聚为2支，亚洲产穿山甲中，中华产山甲、印度穿山甲与马来产山甲又别离聚为一支，种间区别置信度≥99%，标明Cytb和COⅠ序列用于穿山甲的分子判定具有可行性。2种序列所建NJ树中，样品J8，J11，J12，J15，J16，R2均与NCBI上下载的中华穿山甲序列聚为一支，阐明这6个样品为正品中华穿山甲。而样品R6，R3，J6为印度穿山甲，R5为树穿山甲，其他样品为马来穿山甲。

3.2 特异性引物挑选成果

用根据Cytb和COⅠ序列规划的中华穿山甲位点特异性引物以各穿山甲样品DNA为模板进行PCR扩增，挑选取得一对特异性引物COⅠ-S10/A5。该对引物对中华穿山甲在必定条件下能扩增出400 bp的特异片段，而印度穿山甲、马来穿山甲和树穿山甲扩增成果均为阴性；而COⅠ通用引物对一切DNA模板均能有用扩增出750 bp亮堂明晰的片段，证明引物COⅠ-S10/A5对中华穿山甲具有杰出的特异性（图3）。

3.3 PCR扩增反响条件优化

3.3.1 DNA模板量的查询 对20 μL PCR 反响体系中的模板DNA用量进行了查询（图4），DNA在3～100 ng时，中华穿山甲（1，2）能扩增出特异性条带，且随模板量削减条带变暗，模板量降至3 ng时条带现已难以辨识；伪品在DNA模板量3～100 ng扩增成果均为阴性，因而主张本办法中DNA模板用量以3～100 ng为宜。

3.3.2 退火温度和PCR循环次数对成果的影响 如退火温度在55～60 ℃，PCR扩增35个循环时，中华穿山甲（1，2）能扩增出特异性条带（阳性），且伪品扩增成果为阴性。当PCR循环数削减至28个，正品特异性条带显着变弱，乃至无法辨识；循环数添加至时，伪品呈现假阳性扩增（图5，6）。

4 定论与评论

2016年9月举办的第17届《濒危野生动植物种国际交易条约》缔约方大会（CITESCoP17）拟经过了将亚洲和非洲的悉数8种穿山甲由本来的《条约》附Ⅱ提升到附录Ⅰ的提案，全面禁止穿山甲的国际交易。查询数据显现，野生穿山甲在亚洲地区现已很难找到，对穿山甲药用和食用需求，影响了非洲穿山甲不合法私运交易网络的构成[17]。Zhang H等搜集了很多私运穿山甲样本并运用法医学中DNA取证的办法对这些样本的来历及或许的私运途径进行了剖析，证明了DNA取证的办法在野生动物不合法交易检测上的运用价值[18]。作为我国传统用药的仅有正品来历，中华穿山甲的精确快捷辨别能必定程度上有用按捺外来穿山甲种类向我国的输入，并有用冲击国内中华穿山甲的不合法捕猎。

本研讨经过特异引物挑选和条件优化，断定20 μL PCR反响体系时，根据COⅠ序列规划的引物COⅠ-S10/A5在DNA模板加样量3～100 ng，退火温度55～60 ℃时，扩增35个循环可将正品中华穿山甲与其他伪品进行有用的辨别。因为穿山甲样品安排的特殊性，选用了Promega Wizard SV Genomic DNA Purification System进行穿山甲鳞甲和筋膜的DNA提取。该办法操作简略，无酚、氯仿等污染，提取的穿山甲DNA经微量核酸定量仪检测，其质量浓度在5～100 mg·L^-1，可直接用于本文所挑选的特异性引物进行判定。本研讨选用该试剂盒进行了编造穿山甲片DNA的提取试验，发现取样量20 mg左右时，DNA量为5～20 mg·L^-1，且蛋白和小分子污染较为严峻，选用特异性引物进行辨别时重复性不高，因而关于编造甲片的辨别研讨有待进一步优化试验进程。

关于符号片段，别离扩增了线粒体基因片段COⅠ（cytochrome oxidaseⅠ）和Cytb（cytochrome b），其间COⅠ序列为现在研讨者遍及引荐的动物DNA通用条形码序列，对鸟类、鱼类、节肢动物、哺乳动物等均具有很好的物种辨别能力[19]。此外，线粒体DNA具有的分子结构相对简略，较核DNA简单检测且不易降解的优势，适用于穿山甲鳞甲这类DNA提取困难的样品检测。

此外，本研讨中还构建了穿山甲根据Cytb和COⅠ序列的体系聚类（NJ）树，成功将不同种穿山甲区别开来，证明Cytb和COⅠ序列均适用于穿山甲的分子判定。NJ树图显现，亚洲产区和非洲产区的穿山甲别离聚为一支，其下不同种穿山甲又各自分支集合。中华穿山甲在我国散布有3个亚种：指名亚种（M. p. pentadactyla）散布于台湾；华南亚种（M. p. aurita）见于华南一带 14 个省区；海南亚种（M. p. pusilla ）产于海南[1]。但三者详细辨别信息罕见文献报导。本文中Cytb和COⅠ序列的NJ树均显现，在中华穿山甲分支内部，样品J11，J12，J15，J16与样品J8，R2及NCBI上下载的中华穿山甲序列又别离聚为一支，阐明这2个分支地点样品或许为两个不同的中华穿山甲亚种，为中华穿山甲分类维护与研讨供给参阅根据。

[参阅文献]

[1] 张立，李麒麟，孙戈，等. 穿山甲种群概略及维护[J]. 生物学通报，2010，45（9）：1.

[2] 吴诗宝. 穿山甲专家组会议在新加坡举行，我国穿山甲晋级为极度濒危动物[J]. 兽类学报，2013，33（3）：214.

[3] Soewu D A，Adekanola T A. Traditional-medical knowledge and perception of pangolins （Manis sps） among the Awori people，Southwestern Nigeria[J]. J Ethnobiol Ethnomed，2011，7（5）：446.

[4] Boakye M K，Pietersen D W，Kotzé A，et al. Ethnomedicinal use of African pangolins by traditional medical practitioners in Sierra Leone[J]. J Ethnobiol Ethnomed，2013，10（1）：76.

[5] Boakye M K，Pietersen D W，Kotzé A，et al. Knowledge and uses of African pangolins as a source of traditional medicine in Ghana[J]. PLoS ONE，2014，10（1）：e0117199.

[6] 胡轩铭，温成平，谢志军. 穿山甲古今运用的沿革研讨[J]. 中华中医药学刊，2012，30（3）：590.

[7] 唐松元，段文武，黄兴国，等. 穿山甲资源现状和人工饲养对策及发展前景[J]. 湖南林业科技，2012，39（3）：75.

[8] 吴诗宝，刘延发，张迎梅，等. 我国穿山甲受危情况评价[J]. 运用与环境生物学报，2004，10（4）：456.

[9] 吴诗宝，马广智，唐玫，等. 我国穿山甲资源现状及维护对策[J]. 自然资源学报，2002，17（2）：174.

[10] 刘曦庆，彭建军，高赛飞，等. 穿山甲的私运交易概略、物种判定与形状比较[J]. 林业实用技能，2011，29（5）：11.

[11] 尹峰，卢琳琳，梦梦，等. 穿山甲的交易与维护[J]. 野生动物学报，2016，37（2）：157.

[12] Gaudin T J，Emry R J，Wible J R. The phylogeny of living and extinct pangolins （Mammalia，Pholidota） and associated taxa： a morphology based analysis[J]. J Mamm Evol，2009，16（4）：235.

[13] 刘逊，朱缨，胡芳，等. 濒危物种穿山甲的产品查询及其基源判定[J]. 亚太传统医药，2015，11（15）：35.

[14] Zhang Y P，Shi L M. Genetic diversity in the Chinese pangolin （Manis pentadactyla ）： inferred from restriction enzyme analysis of mitochondrial DNAs[J]. Biochem Genet，1991，29（9/10）：501.

[15] Tobe S S，Linacre A. A new assay for identifying endangered species in traditional east Asian medicine[J]. Forensic

Sci Int Genet，2011，3（1）：e232.

[16] Gaubert P，Machordom A，Morales A，et al. Comparative phylogeography of two African carnivorans presumably introduced into Europe： disentangling natural versus human-mediated dispersal across the Strait of Gibraltar[J]. J Biogeogr，2011，38（2）：341.

[17] Nijman V，Zhang M X，Shepherd C R. Pangolin trade in the Mong La wildlife market and the role of Myanmar in the smuggling of pangolins into China[J]. Gecco，2016，5：118.

[18] Zhang H，Miller M P，Yang F，et al. Molecular tracing of confiscated pangolin scales for conservation and illegal trade monitoring in southeast Asia[J]. Gecco，2015，4：414.

[19] 張辉，姚辉，崔丽娜，等. 根据COⅠ条形码序列的《我国药典》动物药材判定研讨[J]. 国际科学技能——中医药现代化，2013，15（3）：371.

[责任编辑 吕冬梅]