催眠诱导 催眠睡茄Withania somnifera 毛状根的诱导及睡茄素A的组成
王凤英+孙一铭+吕翠萍+程孟琪+张来+孙敏
[摘要] 睡茄素A是存在于催眠睡茄的根和叶中的首要次生代谢产品之一。该试验以催眠睡茄的无菌苗叶片为外植体，运用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄毛状根，诱导率达30%。一起，运用HPLC测定野生催眠睡茄植株的根、茎、叶和30 d液体悬浮培育的毛状根中睡茄素A的含量成果标明，毛状根中睡茄素A均匀质量分数为1.588 mg·g-1，是野生植株均匀含量的1.96倍；其间，毛状根系M3的睡茄素A含量最高，质量分数到达1.783 mg·g-1，是野生型催眠睡茄植株根含量的1.51倍。因而，能够培育催眠睡茄毛状根来取得睡茄素A。
[关键词] 催眠睡茄；毛状根；睡茄素A；HPLC
[收稿日期] 2013-07-16
[基金项目] 中心高校根本科研业务费专项资金项目（XDJK20120088）；贵州省功用资料与资源化学特征要点试验室敞开基金项目
[通讯作者] *孙敏，Tel：（023）68254061，E-mail： jwcsm@swu.edu.cn
[作者简介] 王凤英，硕士研讨生，E-mail：misswangfengying@163.com
催眠睡茄Withania somnifera L为茄科Solanaceae睡茄属Withania植物，又叫印度人参，首要成长在印度、巴基斯坦、埃及、刚果、南非等地。催眠睡茄植株中含有睡茄素类、醉茄素类等各种生物碱[1]，具有抗炎、抗压、抗氧化、抗肿瘤等成效，常被用于医治哮喘、老年痴呆、焦虑、帕金森综合症及认知神经紊乱等[2]。在印度，催眠睡茄还常被用于壮阳、冷静、延伸寿数等。睡茄素A是睡茄属植物的首要有效成分，研讨标明，其有较强的抗癌活性[3-4]，能够促进神经突起的分支和突触的重建，被广泛运用于医治老年痴呆、帕金森症等各种神经性疾病[5]。
跟着对催眠睡茄活性成分的药理学研讨和剖析，其药理作用清晰明确，加快了催眠睡茄在保健及医药中的开发和运用，其需求也日益增长。经过现代生物技能手段来进步次生代谢产品的生物组成量势在必行，国内外经过组织培育技能[6-10]来扩展催眠睡茄的种质资源，以进步其次生代谢产品含量。毛状根的构成是发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA片段在植物核基因组中整合及表达的成果，其培育系统在生物量的添加，药用有效成分的堆集以及出产稳定性方面都具有其共同的优越性，使得运用毛状根培育出产植物次生代谢产品具有极大的出产潜力[11]。原植物中睡茄素A的含量较低[12]无法满意不断添加的市场需求。国外有将催眠毛状根进行培育条件优化[13]及将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入到催眠睡茄毛状根中以进步睡茄素A的含量[14]来处理睡茄素A的资源缺少问题的相关报导，但作用不显着。因而，本试验运用发根农杆菌C58C1诱导催眠睡茄叶片发生毛状根，一起优化睡茄素A的提取办法，为树立和挑选高效组成睡茄素A的优秀毛状根系统奠定根底。
1 资料
催眠睡茄种子由西南大学梁国鲁教授惠赠。以培育20 d的无菌催眠睡茄麦苗的叶片为外植体。
发根农杆菌C58C1（C58C1 是根癌农杆菌经“Disarmed”改造后，保存Helper 质粒，导入pRiA4 质粒而成的发根农杆菌）由西南大学廖志华教授供给。
岛津 LC-20AD自动进样高效液相色谱仪；睡茄素A对照品购于Nature Remedies Private Limited，（HPLC≥95%）。
2 办法
2.1 C58C1菌株的活化
取发根农杆菌C58C1菌种，于YEB附加40 mg·L-1利福平（Rif）的固体培育基划线培育，挑取单菌落，接种于10 mL附加40 mg·L-1利福平（Rif）的YEB液体培育基中，200 r·min-1，27 ℃振动培育24 h为第1次活化菌液，取100 μL第1次活化菌液接种于50 mL的YEB附加40 mg·L-1Rif的液体培育基中，200 r·min-1，27 ℃振动培育至A6000.3左右（约12 h），参加乙酰丁香酮（AS）至终浓度为100 μmol·L-1，持续活化3 h。将50 mL活化好的菌液移入无菌离心管中，4 000 r·min-1，离心10 min，用50 mL附加有100 μmol·L-1乙酰丁香酮（AS）的MS液体培育基重悬菌体，持续于200 r·min-1，27 ℃振动培育30 min，取得的菌体用于转化催眠睡茄外植体[15]。
2.2 催眠睡茄毛状根的取得
将处理好的催眠睡茄叶片浸入C58C1的悬浮液中，200 r·min-1，27 ℃振动20 min后，用无菌滤纸吸干叶片外表的菌液，接种于附加100 μmol·L-1乙酰丁香酮（AS）的MS固体培育基中，27 ℃漆黑共培育4～5 d至叶片周围有菌圈呈现时，取出叶片，无菌水200 r·min-1振动洗刷3次，每次10 min，无菌吸水纸吸干水分后接种于附加300 mg·L-1的头孢噻肟钠（Cef）的MS固体培育基中光照培育，每4 d替换1次培育基，直至毛状根长出。
2.3 毛状根的液体培育
当毛状根成长至3 cm左右时，剪下别离接种于含300 mg·L-1的头孢噻肟钠（Cef）的1/2 MS培育基中，每7 d剪取毛状根的根尖继代培育，继代5～6次后，将毛状根转移至YEB琼脂培育基上培育7 d，检测毛状根无农杆菌污染后，接种于1/2 MS液体培育基中，110 r·min-1，27 ℃振动培育。每20 d左右替换一次培育基，培育30 d左右收成毛状根用于分子检测后，挑选性状保持稳定且成长敏捷的阳性毛状根克隆进行扩展培育，30 d左右测定睡茄素A的含量。endprint
2.4 催眠睡茄毛状根的rolB基因的分子检测
别离取不同无性系的毛状根用CTAB[16]法提取毛状根的DNA，选用PCR扩增的办法检测毛状根中virD基因和rolB基因，扩增系统运用Promega公司的GoTaq？Green Master Mix. 参照张显强等[15]的检测办法。
2.5 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素A的HPLC检测
2.5.1 色谱条件 Symmetry-C18色谱柱；活动相A为三重蒸馏水，活动相B为试剂乙醇（乙醇-甲醇-异丙醇 90.6∶4.5∶5.9）与甲醇1∶1混合；活动相进样体积比为1∶1；检测波长 230 nm；柱温 38 ℃；流速 1 mL·min-1；进样体积为20 μL。
2.5.2 睡茄素A规范曲线的制作 精细称取睡茄素A对照品，别离装备成质量浓度为200，150，100，50，25 mg·L-1的对照品贮备液，别离进样记载相应的峰面积，制作规范曲线方程。
2.5.3 睡茄素A的提取和测定 将野生型催眠睡茄植株的根、茎、叶和毛状根60 ℃烘干至恒重，充沛研磨后过60目筛。睡茄素A提取办法参照[17]，准确称取各样品干粉1 g，参加甲醇10 mL，超声提取20 min，室温静置5 h，12 000 r·min-1离心10 min，汲取上清，过滤膜。取样品滤液20 μL注入高效液相色谱仪中，记载峰面积，核算睡茄素A的含量。
3 成果与剖析
3.1 毛状根的诱导
外植体经C58C1浸染共培育5 d后，光照培育10 d左右开端有毛状根长出，外植体毛状根均匀诱导条数为4条，15 d毛状根诱导率达30%左右，表现出无向地性，绒毛较多的特色。催眠睡茄毛状根成长敏捷，分枝较多，成长7 d左右长3～4 cm，取不同的毛状根别离接种于1/2MS+Cef的固体培育基后，毛状根成长敏捷。经除菌后毛状根转入1/2MS+Cef的液体培育基中振动培育，毛状根敏捷成长（图1）。跟着液体悬浮培育时刻的添加，毛状渊源白色逐步转变为淡黄色，培育30 d左右时，毛状根呈现细微的褐化现象，生物量显着添加，阐明次生代谢产品已经在毛状根内很多组成和堆集，能够收成毛状根进行分子检测和睡茄素A的测定。
3.2 毛状根的rolB基因的检测
Ri质粒上的T-DNA中的rol宗族基因与毛状根的构成具有亲近的联系，对毛状根基因组中的rol宗族基因的检测能够判定T-DNA是否已整合到植物基因组中[18]。用催眠睡茄毛状根的DNA作为模版，以f-VirD1/r-VirD1为引物进行PCR扩增检测VirD基因，扫除农杆菌基因组对毛状根基因组污染
A.10 d左右的毛状根；B.除菌培育基中毛状根成长状况；C.液体培育。
图1 催眠睡茄毛状根的取得
Fig.1 Hair roots of Withania somnifera
导致的假阳性的成果；以f-rolb/r-rolb为引物进行PCR扩增检测rolB基因，以野生型催眠睡茄基因组模板为阴性对照，发根农杆菌菌体为阳性对照检测催眠睡茄毛状根系中的rolB基因。检测成果标明（图2），32个毛状根系中，有2个毛状根系中检测出存在农杆菌的污染，其他的30个毛状根均未检测出VirD基因；在检测的30个毛状根单克隆系中，仅有1个单克隆未检测到rolB基因，阳性率为96.67%。因而，挑选性状保持稳定且成长敏捷的阳性毛状根克隆进行扩展培育，以测定睡茄素A的含量。
M. DL 2 000 DNA Marker；+. 阳性对照为C58C1菌株；-.阴性对照为野生型催眠睡茄；1～10.部分不同的催眠睡茄毛状根单克隆。
图2 催眠睡茄部分毛状根rolB基因的PCR检测
Fig.2 PCR detection of rolB gene in hair roots of Withania somnifera
3.3 毛状根中睡茄素A的测定
3.3.1 规范曲线的制作 以睡茄素A为对照品，测得睡茄素A在230 nm处有最大吸光值，以不同浓度的睡茄素A规范液进样后于230 nm波长下测定出峰时刻和记载相应峰面积，得出睡茄素A的规范峰谱图（图3）。以进样浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，制作睡茄素A的规范曲线为Y=10 653.26X+475.967 7，相联系数R2=0.999 93。
A.对照品；B.样品；a.睡茄素A。
图3 睡茄素A的HPLC图
Fig.3 HPLC chromatigram of withanolide A and sample
3.3.2 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素A的测定 挑选10个液体培育30 d且成长敏捷的的毛状根无性单克隆系，及成长旺盛的野生型催眠睡茄植株的根、茎和叶，冷冻干燥后破坏过60目筛，提取睡茄素A进行HPLC测定。睡茄素A含量测定成果（表1）标明，野生型催眠睡茄植株中睡茄素A的均匀质量分数为0.808 mg·g-1，根中睡茄素A的含量最高，为1.180 mg·g-1；而测定的10个毛状根系中睡茄素A的含量都显着高于野生催眠睡茄根的含量，均匀质量分数为1.588 mg·g-1，是野生植株均匀含量的1.96倍；其间毛状根系M3的睡茄素A最高到达1.783 mg·g-1，是野生催眠睡茄植株均匀含量的2.21倍，根的1.51倍。因而，试验经过对催眠睡茄毛状根的诱导并取得高效堆集睡茄素A的毛状根系M3，为经过毛状根培育高效率取得睡茄素A奠定了根底。endprint
表1 催眠睡茄植株及毛状根中睡茄素A的测定（±s，n=3）
Table 1 Withanolide A content in organ and hairy root of Withania somnifera（±s，n=3）
4 评论
本试验以无菌系统的催眠睡茄叶片为外植体，进行毛状根的诱导，降低了外植体的污染率。一起，避免了部分催眠睡茄外植体因为消毒剂的毒害导致逝世而降低了毛状根的诱导率。在运用发根农杆菌C58C1浸染时，用无菌针于叶片上刺2～3个孔[15]，能够使发根农杆菌更充沛地浸染外植体，将Ri质粒上的T-DNA整合到催眠睡茄叶片的核基因组中，进步毛状根的诱导率。当液体培育30 d左右时，毛状渊源白色变逐步变为淡黄色，且有细微的褐化现象，阐明次生代谢产品已经在毛状根内很多组成和堆集，能够收成毛状根进行分子检测和睡茄素A的提取和测定。
在提取睡茄素A时，M Ganz 等[17]的提取办法相对于N Praveen等[19]的作用较好。而本试验在提取过程中，样品参加甲醇超声提取后，室温静置5 h，可使睡茄素A更充沛地溶于甲醇中，到达更佳的提纯作用。
运用HPLC具有别离效率高，挑选性好，检测灵敏度高级的长处，对野生催眠睡茄植株的根、茎、叶中睡茄素A含量的测定成果标明，野生催眠睡茄根中的含量显着高于茎和叶，与M Ganzera等[17]的成果共同。Hosakatte N Murthy[12]探讨了SH，LS，N6，MS不同培育基对睡茄素A质量分数的影响，发现附加40 g·L-1蔗糖的1/2MS液体培育基培育催眠睡茄毛状根，睡茄素A到达157.4 μg·g-1，M H Mirjalili等[14]将拟南芥中的鲨烯合酶基因转入到催眠睡茄毛状根中，睡茄素A质量分数到达4.63 μg·g-1，而本试验取得的高产睡茄素A的毛状根系M3，其睡茄素A的堆集量（1.783 mg·g-1）显着高于Hosakatte N Murthy和M H Mirjalili的试验成果。这为运用催眠睡茄毛状根出产睡茄素A及进一步取得高产睡茄素A毛状根系的优秀再生植株奠定了前期的试验根底。
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Hair roots induction and culture of Withania somnifera and
its withanolide A synthesis
WANG Feng-ying， SUN Yi-ming， LV Cui-ping， CHENG Meng-qi， ZHANG Lai， SUN Min
（1.SchooL of Life Sciense， Southwest University/Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region（MOE），
Chongqing 400715， China；
2. Special and Key Laboratory of Functional Materials and Resource Chemistry of Guizhou Provincial
Education Department， Anshun University， Anshun 561000， China）
[Abstract] Withanolide A is a biologically active secondary metabolite occuring in roots and leaves of Withania somnifera. In the present study， adventitious roots from leaf explants of W. somnifera were induced for the production of withanolide-A by Agrobacterium tumefaciens strain C58C1 to obtain hair roots. Hair roots induction rate reached 30%. The withanolide A was determined by HPLC in different hair roots lines and different parts of W. somnifera. The average content of withanolide A in all hair roots lines were 1.96 times as high as that in wild-plant， the concentration of withanolide A in hair roots （1.783 mg·g-1dry weight） were 1.51 times as high as the roots of wild W. somnifera （1.180 mg·g-1dry weight ）， respectively. It is possible to obtain withanolide A from hair roots culture of W. somnifera.
[Key words] Withania somnifera； hair roots； withanolide A； HPLC
doi：10.4268/cjcmm20140507
[责任编辑 吕冬梅]endprint