穿山龙价格 水培条件下氮素对拟巫山淫羊藿产值和黄酮类成分的影响
张云风+郭宝林+杨相波+李砾+姜志海+莫玉敏
[摘要] 选用水培办法研讨了不同氮濃度和氮素形状及配比对拟巫山淫羊藿产值和黄酮类成分的影响。氮浓度设7个处理组N0～N6，别离为0，2.5，5.0，7.5，10.0，13.0 mmol·L-1；氮形状设5个处理组T1～T5，硝铵比NO3-N/NH4-N依次为5∶0，4∶1，2.5∶2.5，1∶4，0∶5，总施氮量为5 mmol·L-1。成果标明，随氮浓度的增大，拟巫山淫羊藿的生物量和叶干重均显着升高，N5组的生物量和叶干重别离比N0组和N4组高29%，23%和36%，23%（P<0.05），但与N6组不同不显着；根，茎干重改变不显着。净光合速率及各光合色素含量在N3～N5组中较高。朝藿定A，B，C，淫羊藿苷及总黄酮含量在N3组最低，N4组俄然升高，N4～N6组改变不大，朝藿定C的含量最高的N5组比含量最低的N3组高131%（P<0.05）。在不同硝铵比处理组中，生物量，单株叶干重，茎干重在硝铵比为2.5∶2.5时最大，单纯施用硝态氮（T1）和铵态氮处理（T5）最低（二者差异不显着）；各光合色素含量和净光合速率在T3和T4组最低，其他3组较高。氮形状对黄酮含量的影响远小于氮浓度的影响。朝藿定C的含量在T1组中最高，但仅比T2～T5组高5%～8%（P<0.05），其他4组间差异不显着。朝藿定A，B，淫羊藿苷及总黄酮含量在T1组中均较高，在T2组中最低，T1组别离比T2组高41%，62%，27%（P<0.05）。拟巫山淫羊藿为高氮耐受性植物，10.0 mmol·L-1是其成长转向杰出的拐点，最适的氮浓度为10.0～13.0 mmol·L-1，喜爱硝态氮和铵态氮混施，最适的氮形状及配比为2.5 mmol·L-1硝态氮+2.5 mmol·L-1铵态氮。
[关键词] 拟巫山淫羊藿； 氮浓度； 氮形状； 产值； 黄酮
[Abstract] Nitrogen nutrition divided into concentrations and forms for Epimedium pseudowushanense was studied under hydroponic conditions. There were 7 nitrogen concentrations treatments（N0-N6）which nitrogen concentration was 0， 2.5， 5.0， 7.5， 10.0， 13.0 mmol·L-1， respectively， and 5 nitrogen forms and proportions treatments （T1-T5） which NO3-N/NH4-N was 5∶0， 4∶1， 2.5∶2.5， 1∶4， 0∶5 respectively， the total nitrogen applied was 5 mmol·L-1. The results showed that along with the increase of nitrogen concentration， biomass （dry weight） and leaf dry weight increased， which in N5 treatment was 29%， 23% higher than those in N0 and 36%， 23% higher than those in N4 respectively， but not significantly different from N6 treatment. Roots and stem dry weights did not change significantly. Pn and the contents of photosynthetic pigments were higher in N3-N5 treatments. Epimedin A， B， C， icariin and total flavonoids contents were the lowest in N3 treatment， suddenly increase in N4 treatment and only a little change between N4-N6 treatments. N5 treatment with the highest epimedin C content was 131% higher than N3 treatment with the lowest epimedin C content （P<0.05）. While in the nitrogen forms and proportions treatments， biomass， leaf and stem dry weights were the highest in T3 treatment and lower in T1 and T5 treatments， without significance between T1 and T5 treatments. These indicators in T3 treatment were more than 30% higher than those in T1 treatment. The impact of nitrogen concentrations was greater than nitrogen forms on flavonoids. epmedin C content was the highest in T1 treatment， only 5%-8% higher than that in T2-T5 treatments （no significance between 4 treatments）. Epimedin A， B， icariin and total flavonoids contents were higher in T1 treatment， the lowest in T2 treatment， those in T1 treatment was 41%， 62% and 27% higher than T2 treatment respectively （P<0.05）. In a conclusion， E. pseudowushanense is a high nitrogen tolerant plant， 10.0 mmol·L-1 was the boundary point between growing general to well and the optimal nitrogen concentration for it was 10.0-13.0 mmol·L-1. Besides， it prefers to grow in NO-3 plus NH+4 and the optimal proportion was 2.5∶2.5.endprint
[Key words] Epimedium pseudowushanense； nitrogen concentrations； nitrogen forms； yields； flavonoids
拟巫山淫羊藿Epimedium pseudowushanense B. L. Guo是小檗科淫羊藿属多年生草本植物，首要散布于贵州黔东南州。因其叶形状和药材质量与巫山淫羊藿类似，一向被误作为巫山淫羊藿E. wushanense T. S.Ying运用，拟巫山淫羊藿中朝藿定C和其他淫羊藿苷类成分含量较巫山淫羊藿高且质量安稳，现代药理学研讨标明朝藿定C具有与淫羊藿苷类似的效果[1-4]。现在淫羊藿药材资源首要来自于野生，跟着用量大幅添加和破坏性采挖，野生资源蕴藏量逐年锐减，急需完成培育化。拟巫山淫羊藿经十多年的引种驯化，现在在贵州省黔东南州雷山县开始完成了规模化培育，是淫羊藿属中首个完成大面积人工培育的物种，但其养分需求规则需求系统研讨。本研讨组在对拟巫山淫羊藿成长地土壤理化情况查询剖析中发现，氮素对拟巫山淫羊藿的叶产值有显着影响[5]。本文使用水培办法就氮素浓度和氮素形状对拟巫山淫羊藿成长目标和黄酮类成分含量的影响展开研讨。
1 资料
1.1 仪器与试剂
克己水培盆；通气泵（SB-248，中山市松宝电器有限公司）；pH计（ST300，奥豪斯仪器（常州）有限公司）；光合仪（LI-6400XT，美国LI-COR公司）；荧光仪（Dual-Pam-100，德国WALZ公司）；高效液相色谱仪（Flexar FX-15，美国PE公司）；紫外-可见光分光光度计（岛津UV2550，日本岛津制作所）；剖析天平（FA2014N型，上海精细科学仪器有限公司）；循环式真空泵（CA-1111，上海爱朗仪器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500E型，昆山市超声仪器有限公司）。
纯净水（娃哈哈）；甲醇（色谱纯，fisher公司）；乙腈（色谱纯，fisher公司），无水乙醇（剖析纯，北京化工厂）；硝酸钙、硝酸钾、氯化钙、氯化钾、硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾、硼酸、硫酸锰、硫酸铜、硫酸锌、硫酸亚铁、EDTA（剖析纯，天津市克复科技发展有限公司）。对照品朝藿定A、B、C，淫羊藿苷及鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ均由本试验克己，纯度均大于98%。
1.2 植物样品
一年生拟巫山淫羊藿实生苗，采自贵州雷山培育基地的同一块培育地，经郭宝林教授鉴定为拟巫山淫羊藿E. pseudowushanense。试验于2016年10月至12月在药用植物研讨所北京温室培育间进行，温度20 ℃左右，光照强度为63 μmol·m-2·s-1，相对湿度60%，每日光照16 h，漆黑8 h。
2 办法
2.1 试验设计
首先将苗栽种在盛有25% Hoagland养分液的塑料盆（6 L）中进行缓苗。1周后长出新根，再从其间选取成长杰出且巨细共同的实生苗，随机均分为12个组。试验包括2部分，氮浓度试验和氮素形状及配比试验。每个培育盆为1个处理，共30株，包括3个重复，每个重复10株。
氮浓度（硝态氮）试验设有7个处理：0 mmol·L-1（N0），1.0 mmol·L-1（N1），2.5 mmol·L-1（N2），5.0 mmol·L-1（N3），7.5 mmol·L-1（N4），10.0 mmol·L-1（N5），13.0 mmol·L-1（N6），各处理所用养分液中H2PO4-的浓度为0.25 mmol·L-1，K+的浓度为5.0 mmol·L-1，Ca2+的浓度为4.0 mmol·L-1，其他元素及铁盐均与100% Hoagland养分液相同。
氮形状和配比试验设有5个处理，硝铵比NO3-N/NH4-N依次为5∶0（T1），4∶1（T2），2.5∶2.5（T3），1∶4（T4），0∶5（T5），总施氮量为5 mmol·L-1。各处理所用养分液中除氮以外的其他元素及铁盐均与100% Hoagland养分液相同。
每3 d调1次pH（6.00± 0.03），每10 d替换1次养分液。接连处理2个月后对拟巫山淫羊藿进行各项目标的测定。
2.2 取样
从每个处理的每个重复随机选择3株植物，取内侧老练叶片，进行光合参数测定；从每个重复每株取1枚新鲜的老练叶片，剪碎后混匀，测定光合色素含量；10株苗于105 ℃杀青，80 ℃烘干，称量根、茎、叶及全株干重，老练叶片混合破坏，测定黄酮类成分、可溶性糖及可溶性蛋白含量。
2.3 测定项目
2.3.1 光合色素的测定 参照文献[6]。
2.3.2 淫羊藿苷类黄酮的测定 样品溶液的制备：精细称定过3号筛的枯燥样品约0.2 g，置具塞锥形瓶中，精细量取30 mL 50%乙醇，称重，超声提取1 h，放冷，再称重，用50%乙醇补足失重，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
对照品溶液的制备：精细称取各对照品，别离制造成朝藿定A 1.361 g·L-1，朝藿定B 1.163 g·L-1，朝藿定C 2.012 g·L-1，淫羊藿苷1.887 g·L-1，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ 0.991 g·L-1的对照品溶液。
色谱条件：Agela Technologies Venusil MP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；活动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～25 min，25%～27%A；25～30 min，27%～80%A；30～35 min，80%～100%A）；流速 1.0 mL·min-1；柱温 35 ℃；检测波长 270 nm；进样量 10 μL。色谱图见图1。
2.3.3 光合特性目标测定 于上午8：00—11：30測定叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）。样本室内气体流速200 μmol·s-1，叶室CO2浓度600 μmol·mol-1，温度20 ℃，相对湿度53%。红蓝光源，叶室光合有效辐射为63 μmol·m-2·s-1。endprint
2.3.4 可溶性蛋白和可溶性糖的测定 选用改善的考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量[7]，选用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[8]。
2.4 数据剖析
试验数据选用Excel 2016和SPSS 22.0软件进行统计剖析，不同处理间的差异选用单因素方差剖析，多重比较选用Duncan进行。
3 成果与剖析
3.1 HPLC办法学查询
3.1.1 线性联系 别离精细汲取2.3.2项下的各对照品溶液1.0，2.0，5.0，8.0，12.0，15.0，18.0，20.0 μL，按2.3.2项下色谱条件进样，测定峰面积。以峰面积为横坐标（x），进样质量（μg）为纵坐标（y）制作规范曲线，见表1。
3.1.2 精细度 取2.3.2项下的供试品溶液，在2.3.2项色谱条件下接连进样6次，记载色谱峰面积，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ峰面积的RSD别离为 1.8%，1.8%，2.0%，1.4%，2.0%。
3.1.3 重复性 按2.3.2项下办法操作，制备同一 供试品溶液6份，在2.3.2项下色谱条件下测定，记载峰面积，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ峰面积的RSD别离为0.79%，2.4%，2.5%，2.9%，2.6%。
3.1.4 加样回收率 精细称定6份已测定含量的拟巫山淫羊藿样品，每份约0.1 g，参加与0.1 g该样品含量持平的5种对照品，按2.3.2项下办法制备供试品溶液。在2.3.2项色谱条件下进样，记载色谱峰面积，核算回收率，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的回收率和RSD别离是99.74%，1.2%；100.1%，0.92%；100.2%，0.88%；99.91%，1.2%；100.1%，0.92%。
3.2 氮浓度对拟巫山淫羊藿的影响
3.2.1 不同氮浓度对拟巫山淫羊藿成长及生化目标的影响 不同氮浓度显着影响了拟巫山淫羊藿的单株叶干重及单株生物量（干重）。叶干重随氮浓度的增大而添加，N5，N6组显着高于N0～N4组（P<0.05），但N5，N6 2组间和N0～N4 4组间均无显着差异，N5组别离比N0，N4组高35.71%，22.58%。茎干重、根干重及根冠比随不同氮浓度的改变不显着，生物量随氮浓度增大的改变趋势与叶干重类似，可溶性糖及可溶性蛋白的含量随不同氮浓度改变不显着，见表2。
3.2.2 不同氮浓度对拟巫山淫羊藿光合色素含量及光合参数的影响 N0组中叶绿素a的含量最低，N1～N2组较高，N3组最高，N4～N6仅次于N3组（P<0.05），N3组比N2组高33.91%。叶绿素b、叶绿素总量（叶绿素a+叶绿素b）及类胡萝卜素的含量随不同氮浓度的改变趋势与叶绿素a类似，即光合色素的含量随氮浓度添加大体呈增大趋势，见表3。
拟巫山淫羊藿的Pn随氮浓度增大呈逐步增大趋势，N0组的Pn最小，N1，N2的Pn仅高于N0组（P<0.05）；N3～N5组的Pn较大，显着高于N0～N2组；N6组的Pn最大（P<0.05），比N1组高28.36%。全体来看N3～N6组的Pn较大，而N0～N2组的Pn较小。不同氮浓度对Ci也有影响：N3～N6组的Ci较大，而N0～N2组的Ci较小，但差异并不显着。不同氮浓度对Gs及Tr影响不显着。
3.2.3 不同氮浓度对拟巫山淫羊藿黄酮类成分含量的影响 不同氮浓度对拟巫山淫羊藿中不同黄酮化合物的含量均有显着影响，见表4。
朝藿定C的含量在N5组中最高，在N3组中最低（P<0.05），N5组比N3组高130.69%。全体看来，朝藿定C的含量在N4～N6组均较高；N0，N1组居中；N2，N3组的含量最低，N0组比N3组高69.31%（P<0.05）。朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷及总黄酮含量（5种黄酮的含量之和）改变与朝藿定C的改变类似，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ含量改变不同，随氮浓度增大而下降。
不同氮浓度对朝藿定C和总黄酮的产值的影响与对朝藿定C含量的影响简直共同。
3.3 氮形状对拟巫山淫羊藿的影响
3.3.1 不同氮素形状对拟巫山淫羊藿成长及生化目标的影响 不同氮素形状及配比显着影响了拟巫山淫羊藿的单株叶干重、茎干重、根干重、生物量及根冠比，见表5。
叶干重随硝铵比的减小呈先增大后削减趋势。T3组中叶干重最高（P<0.05），比T1组高38.42%，T1和T5组中单株叶干重较低，显着低于其他各组（P<0.05）。茎干重和生物量随不同硝铵比减小的改变趋势与叶干重共同。不同氮素形状及配比对根干重也有显着影响。T1和T3组的根干重无显着不同，T3组别离比T2，T4，T5组高34.76%，28.70%，59.40%，T2，T4，T5 3组间无显着差异。根冠比随硝铵比的减小大体呈下降趋势，T1组比T5组高48.39%。
拟巫山淫羊藿中可溶性糖及可溶性蛋白的含量随不同氮素形状及配比的改变不显着。
3.3.2 不同氮素形状及配比对拟巫山淫羊藿光合色素含量及光合参数的影响 拟巫山淫羊藿中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素的含量随硝铵比减小均呈先下降后升高趋势，其间T3，T4组各色素含量最低（P<0.05），T1，T2，T5组间各色素含量的差异不显着，但均显着高于T3，T4组（P<0.05），T1组中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及类胡萝卜素的含量别离比T3组高11.31%，9.23%，11.15%，8.77%，见表6。
不同氮素形態及配比对拟巫山淫羊藿Pn影响较大。Pn由大到小依次为T1，T2（二者无显着差异）>T5>T3>T4，T2组比T4组高62.38%。不同氮素形状及配比对Ci也有较大影响。T1，T5组的Ci最低，T2，T3，T4组中Ci最高，二者有显着性差异（P<0.05）。endprint
3.3.3 不同氮素形状及配比对拟巫山淫羊藿黄酮类成分含量的影响 氮素形状及配比的差异对不同黄酮化合物含量的影响纷歧，见表7。朝藿定C的含量在T1组中最高，但仅比T2～T5组高4.99%～8.27%（P<0.05），T2～T5 4组间差异不显着。朝藿定A、B，淫羊藿苷及总黄酮含量在T1组中均较高，在T2组中最低，T1组别离比T2组高41.18%，62.07%，26.67%（P<0.05）。而鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量随硝铵比减小而下降。
朝藿定C及总黄酮的产值随硝铵比减小呈增大—减小趋势，T3和T4组产值最高（组间无显着差异），T1和T5组含量最低（组间无显着差异），T3组中朝藿定C及总黄酮的产值别离比T1组高26.67%，25.47%。
4 评论与定论
4.1 氮浓度和氮形状对成长发育的影响
很多研讨标明，植物的成长发育和产值的构成需求适合的氮肥量。不同植物对施氮量的呼应纷歧，大体可分为2种类型：一种是对高氮灵敏的植物，表现为产值随施氮量的增大呈添加-快速下降的趋势，如荞麦[9]、黄芪[10]、杭白菊[11]等；另一种是高氮耐受植物，产值随上肥量的增大呈添加-渠道-下降的趋势，如广藿香[12]、广金钱草[13]、芦荟[14]等。在本试验条件下，拟巫山淫羊藿的叶干重及生物量随氮浓度增大而添加，10.0 mmol·L-1是其成长由一般向杰出改变的拐点，持续增大氮浓度到13.0 mmol·L-1，叶干重和生物量改变不显着，故估测拟巫山淫羊藿归于高氮耐受型植物。这与前期对贵州拟巫山淫羊藿成长地的土样调研的成果共同。此外，其他学者[15-16]在对柔毛和巫山淫羊藿的研讨中得到类似成果。
氮是叶绿素的重要组成成分，缺氮会按捺叶绿素的组成，适合氮肥会促进各光合色素的构成。光合色素参加光合效果光能的吸收、传递和转化等重要环节，对光合效果有十分重要的影响。在本试验中，各光合色素含量及净光合速率随施氮量的改变趋势类似，二者在N0组最低，在N3～N6组较高。这与前人在青冈栎容器苗[17]、玉米[18]等植物上的研讨成果共同。
不同植物在长时间进化中构成了对不同氮素形状的偏向性。很多研讨标明，大都植物在硝态氮和铵态氮混施时成长杰出，如油麦[19]、川芎[20]、半夏[21]等。也有许多植物在硝态氮中成长杰出，如菠菜[22]、黄瓜[23]等。但是关于散布在酸性土壤上的杜鹃花科的蔓越橘[24]和长时间成长在水渍环境中的水稻[25]、黑麦草[26]等植物而言，铵态氮是比硝态氮更好的氮源。只要极少数植物在纯铵态氮和纯硝态氮环境中均能成长杰出，如甜菜、棉花、高粱[27]等。关于拟巫山淫羊藿来说，最适的氮形状为2.5 mmol·L-1硝态氮+2.5 mmol·L-1铵态氮，此刻植物叶、茎、根干重均最大。纯硝态氮及纯铵态氮处理下，光合色素含量及光合速率较高，而生物量却不高，这或许与叶片较小和增厚有关。
4.2 氮浓度和氮形状对淫羊藿苷类黄酮成分的影响
氮浓度对黄酮类含量有显着影响。朝藿定C的含量在N4组中较N3组有俄然升高，并在N5组又有升高，含量最高的N5组比含量最低的N3组高130.69%（P<0.05），无氮的N0组和低氮组（N1，N2组）的朝藿定C含量也高于N3组，N0组比N3组高69.31%（P<0.05）。不同氮浓度对朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷及总黄酮含量的影响与朝藿定C类似，但是鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量随氮浓度增大而下降。其他学者报导低氮会使西红柿叶片中槲皮素、山柰酚及鼠李素的含量升高[28]，小荨麻叶片[29]中槲皮素类化合物含量升高。这与5种黄酮类成分在0～5 mmol·L-1随氮浓度添加大体呈下降的成果类似。5种黄酮类成分在7.5～13.0 mmol·L-1较高，这与其他学者在枸杞[30]、黄芩[31]及莳萝[32]中的研讨成果类似，这或许与植物本身的养分特性有关，也或许与次生代谢物杂乱的组成、调控进程有关，但相关机制尚不清楚，有待进一步研讨。
氮形状对黄酮含量的影响远小于氮浓度的影响。朝藿定C的含量在T1组中最高，但仅比T2～T5组高4.99%～8.27%（P<0.05），其他4组间差异不显着。朝藿定A，B、淫羊藿苷及总黄酮含量在T1组中均较高，在T2组中最低，T1组别离比T2组高41%，62%，27%（P<0.05）。而鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的含量随硝铵比减小而下降。纯硝态氮下5中黄酮成分含量均最高的原因或许与此刻植物叶干重最低引起的浓缩效应有关，但详细机制仍需进一步研讨。朝藿定C和总黄酮的产值随硝铵比的减小呈增大—减小趋势，T3，T4组产值最高（2組间无显着差异）。
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[责任编辑 吕冬梅]endprint