病程相关蛋白 三七病程相关蛋白PR102基因的克隆、表达及功用开始剖析
杨丹 包燚 陈丽梅 崔秀明
[摘要]在转录组测序的根底上，选用逆转录聚合酶链式反响（RTPCR）技能，从三七主根中别离到三七病程相关蛋白10 （pathogensis related protein 10，PR10）基因，命名为PnPR102，测序成果标明该序列长465 bp，编码154个氨基酸。氨基酸序列同源性及体系发育树剖析发现，PnPR102与人参的PR102蛋白同源性最高，具有典型的病程相关蛋白Bet v I 保存结构域。构建了重组载体pET32a（+）PnPR102，在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达交融蛋白，优化诱导条件，PnPR102交融蛋白在E coli BL21中以可溶性和包容体蛋白2种方式很多表达。纯化上清中的重组蛋白，运用纸片法剖析纯化重组蛋白的体外抑菌活性，其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有必定的抑制作用，猜想该基因或许参加了三七抗根腐病的防御反响。
[要害词]三七； 根腐病； 病程相关蛋白； 原核表达
Molecular cloning， bacterial expression analysis and functional
characterization of pathogenesisrelated PR102 gene in Panax notoginseng
YANG Dan1， BAO Yi1， CHEN Limei1， CUI Xiuming1，2， LI Kunzhi1*
（1Faculty of Life Science and Technology， Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， China；
2 Key Laboratory of sustainable utilization of Panax notoginseng Resources of Yunnan Province， Kunming 650500， China）
[Abstract]Base on the transcriptome analysis and RTPCR techniques，a pathogenesisrelated protein 10 gene was isolated from Panax notoginseng root and named as PnPR102 Bioinformatics and phylogenetic trees analysis revealed that open reading frame （ORF） of PnPR102 was 465 bp in length，encoding 154 amino acids，containing one typical conserved domain of pathogenesis related protein Bet v I family， and showed high similarity with that from P ginseng The recombinant expressed plasmid pET32a（+）PnPR102 was expressed in Escherichia coli BL21 The expression conditions were optimized and it could be expressed well in soluble and inclusion body protein Purified PnPR102 recombinant protein from the supernatant of cells was used to analysis the pathogen resistance activity by paper method The purified recombinant protein could inhibit typical root rot disease pathogen （Fusarium solani and Cylindrocarpon destructans）growth evidently， we conjecture that PnPR102 may participated in defense response of P notoginseng resistance to root rot disease pathogen
[Key words]Panax notoginseng； root rot disease； pathogenesisrelated protein； prokaryotic expression
遭到致病菌的侵染后，植物中的一系列基因呼应而上调表达，其间的一些基因與防御反响相关，包括病程相关蛋白（PR）和抑菌基因，其经过增强其蛋白活性来进步抗病才能。PR蛋白被认为可被病原菌和非生物钳制诱导[12]。依据PR蛋白的结构和功用，现在PR蛋白在单子叶植物和双子叶植物中被发现并已确认了17个宗族[3]。PR10是种子植物中广泛散布的一种PR蛋白，它与树木花粉过敏原和食物过敏源十分类似，归于Bet v Ⅰlike 超宗族[4]，这类基因编码的蛋白质相对分子质量在15～19 kDa，等电点偏酸性，无信号肽、属胞内蛋白（intracellular pathogenesisrelated proteins，IPR）。PR10除了与植物的生物及非生物钳制密切相关，还在植物的成长发育，次级代谢等进程中起着重要作用[58]。依据标明，PR10直接参加植物的防卫反响，具有体外抗菌活性或核酶活性[6，9]。endprint
三七Panax notoginseng （Burk） FHChen为我国传统的贵重中药材，多年来，其规模化培育遭到以根腐病、白粉病等病害的严峻约束，其间，根腐病终年发病率为5%～20%，严峻的达70%以上，乃至绝收，且成长年限越长病害越严峻[1013]，现在根腐病的操控手法主要以抗菌性农药的很多施用为主，根腐病的无害化防治已经成为了三七培育技能研讨的熱点和难点问题。三七根腐病病原菌比较复杂，致病菌包括细菌中的假单胞杆菌（Pseudomonas sp，真菌中的坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans，C didynum、镰刀菌Fusarium solani，F solani f sp radicicola，F oxysporum Schlecht，F scirpi Lamb等，通常以坏损柱孢菌、镰刀菌或假单胞菌中某一类为主，数种病原菌复合侵染，加快根系腐朽[11，13]。
本研讨经过克隆三七中的PR102基因的编码序列，并进行生物信息学剖析。经过原核表达载体将三七PR102基因转入大肠杆菌，进行重组蛋白的很多表达和纯化，经过研讨三七PR102重组活性蛋白对三七要害根腐病致病菌的抑菌作用，为经过基因工程手法进步三七抗病性研讨奠定必定的根底。
1资料与办法
11样品二年生三七由云南省农业科学院药用植物研讨所供给，经昆明理工大学崔秀明研讨员判定。三七PR蛋白抑菌实验所用菌株腐皮镰刀菌F. solani和坏损柱孢菌C. destructans，测验真菌由云南大学张克勤教授赠送，并报导了以上致病菌的别离、判定、致病性测定等研讨成果。
12总RNA的提取、检测及cDNA榜首链组成三七总RNA提取选用TRIZOL法从三七叶片器官中提取总RNA，运用分光光度计和1%琼脂糖电泳检测所提取RNA的纯度和完好性。以RNA为模板，oligo（dT）18为反转录引物，依照TaKaRa 公司的Prime ScriptTM RT Reagent 试剂盒阐明书操作。
13PnPR102基因克隆与剖析转录组测序筛选出表达差异显着的病程相关蛋白PR102，从CDS文件中取得PR102的拼接序列，将此片段用MEGA软件和三七附近的物种人参的全长PR102序列进行剖析，发现该片段具有3′端和5′端。规划特异引物PR10F（5′GGATCCatgggtgtccaaaagaccgaaac3′，GGATCC为BamHI酶切位点）和PR10R（5′GAATTCctaatttgctaggaggtaagcttcaacagc3′，GAATTC为EcoRI酶切位点），选用大连宝生物公司供给的高保真PCR反响酶扩增该基因的开放阅读框，收回DNA片段，衔接pMD18T克隆载体，转化，进行检测，测序。将测序成果进行序列比对，终究断定并取得三七PR102基因的完好ORF。
经过wwwExPASyProtParamtoolhtm 在线剖析该基因编码氨基酸巨细及其等电点，一起运用InterProScan软件剖析PnPR102蛋白的保存结构域，猜想其或许的信号肽区域和跨膜区域，运用DNAMAN对三七及人参、胡萝卜、芹菜等植物中PR10基因编码蛋白的类似性及进化联系进行剖析。
14原核表达载体的构建将测序检测正确的pMD18TPnPR102载体质粒用约束性内切酶BamHI和EcoRI双酶切，收回PnPR102基因片段。将pET32a（+）质粒用约束性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，收回线性载体片段。将收回的PnPR102基因片段和收回后的线性质粒载体进行衔接，构建pET32a（+）PnPR102原核表达载体。进行PCR检测，测序判定。
15重组蛋白的诱导表达和纯化经过热刺激法将测序正确的pET32a（+）PnPR102的重组载体转入大肠杆菌的感受态细胞BL21中。探索蛋白诱导条件，规划条件：IPTG浓度05，10，15 mmol·L-1，诱导时刻2，4，6，8 h和诱导温度37，28，20 ℃，进行诱导。诱导后搜集菌体，进行细胞破碎，别离搜集上清和沉积，进行SDSPAGE剖析。
依据康为试剂可溶性蛋白纯化试剂盒的阐明书，对PnPR102的重组蛋白进行纯化，为优化蛋白纯化条件，设置了不同的洗脱液条件进行洗脱，终究将纯化后的蛋白进行SDSPAGE检测。
16重组蛋白的抑菌实验选用已断定的三七根腐病典型病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans为测验菌，选用滤纸片法测定提取物对测验根腐病病原真菌的抑菌活性。用打孔器将定量滤纸打成圆形纸片，121 ℃高温灭菌20 min，烘干备用。在培育皿（直径90 mm）中制备好灭菌的固体PDA培育基，运用接种针挑取少数三七根腐病病原真菌菌丝接种到PDA培育基上，28 ℃培育箱中培育96 h，开始构成圆形菌丝体。取不同浓度的PnPR102纯化重组蛋白滴到灭菌纸片上，晾1 min，将纸片放到PDA培育基中的病原菌菌丝体上，用20 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液（pH 70）作为对照，每个测验菌3个重复。因为2种菌株的成长速率不同，对腐皮镰刀菌F solani选用直径为15 mm纸片，参加纯化PnPR102重组蛋白溶液量为50 mL，对人参锈腐病菌C destructans选用直径为4 mm纸片，参加纯化PnPR102重组蛋白溶液量为10 mL。将培育皿置于28 ℃培育箱中培育24 h，调查抑菌圈的巨细，即对病原真菌的抑制作用。
2成果与剖析
21PnPR102基因的克隆经过转录组测序取得三七PR102序列，进行序列比对剖析，发现该片段具有3′端和5′端。规划特异引物，选用大连宝生物公司供给的高保真PCR反响酶扩该基因的ORF，得到480 bp左右巨细的条带，与意图基因的巨细相符。收回DNA片段，衔接pMD18T克隆载体，转化，进行PCR检测，送测序。将测序成果取出载体序列后进行序列比对，终究断定三七PR102基因的开放阅读框并取得含酶切位点的cDNA片段。将该cDNA片段在GenBank中进行了挂号，命名为PnPR102，注册号为KY129859。endprint
将PnPR102序列输入NCBI中的ORF（open reading frame finder）（wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml） 和DNAMAN软件剖析序列，成果显现PnPR102全长465 bp，编码154个氨基酸（图1）。一起，用ExPASY（ProtParam）软件剖析PnPR102编码的蛋白质相对分子质量为16 5828，理论pI 441，分子式 C743H1180N182O239S3。PnPR102的154个氨基酸中碱性氨基酸（R，H，K）13个，酸性氨基酸（D，E）22个，非极性氨基酸（A，V，L，I，F，W，M，P）有66个，非电离的极性氨基酸（G，S，T，C，Y，N，Q）有53个。其间，带负电荷的氨基酸包括D和E，合计22个，带正电荷的氨基酸包括R和K，共11个。
22PnPR102基因的生物信息学剖析三七PnPR102序列经Blastn比对后，检测与之覆盖率相对较高的几培育物，并取得与三七PnPR102蛋白类似其他植物PR蛋白质序列。挑选与三七PnPR102蛋白亲缘联系相对较近的人参、胡萝卜、香芹菜、山芹菜、马铃薯、丹参、猕猴桃等植物的PR蛋白进行氨基酸序列比对，同源性别离为97%，62%，61%，57%，52%，51%，50%。以上基因编码的氨基酸序列长度类似，在N端和C端有较高的保存性（图2，3）。
运用DNAMAN软件进行同源性剖析，将三七PR102蛋白与人参、胡萝卜、香芹菜、山芹菜、马铃薯、丹参、猕猴桃、芝麻、葡萄的蛋白构建了体系发育树（图4）。三七PnPR102蛋白与人参PR102蛋白（登录号：ACY369431）聚为一类，表现较近的亲缘联系。
运用在线东西InterPro（http：//wwwebiacuk/interpro/search/sequencesearch）对PnPR102蛋白猜想保存结构域（选用默许参数），在PnPR10蛋白中发现其含有1个保存结构域宗族，Bet v I型过敏源（Bet v I type allergen，IPR024949），该宗族中含有病程相关蛋白 Bet v I结构PATHOGENESIS_BETVI，PS00451），坐落89～120位，以及7个Major pollen allergen Bet v I 乳胶蛋白过敏原结构（Major pollen allergen Bet V I，PR00634），别离坐落3～23，26～36，5～59，66～85，85～98，109～125，143～153位；此外，还在PnPR10蛋白中发现START类结构域（STARTlike domain，IPR023393），Bet v I乳胶蛋白结构域（Bet v I/Major protein，IPR000916）；2个Betv I类似结构域（SSF55961，cd07816）；2个未命名的结构域（PTHR31213，PTHR31213：SF14）。Bet v I 型过敏原（Bet v I type allergen）的基因本体（GO）猜想标明，该蛋白参加防御反响（GO：0006952）和生物應激反响（GO：0009607）的生物学进程。
23PnPR102原核表达载体构建、重组蛋白的表达与纯化重组表达质粒转入大肠杆菌BL21中，依据诱导体系的优化，得到最佳诱导条件为：IPTG的终浓度为1 mmol·L-1，诱导时刻为8 h，最佳诱导温度条件为20 ℃。搜集诱导蛋白进行SDSPAGE检测，成果发现在猜想的蛋白相对分子质量35 kDa（载体上蛋白标签巨细约为18 kDa，蛋白质相对分子质量为1705 kDa）左右得到1条十分显着的蛋白条带，而在对照菌株蛋白中没有发现这条带，标明这个蛋白在大肠杆菌的感受态BL21中得到了成功的表达，并且表达量较高。在对菌体进行超声波破碎后，其上清和沉积的SDSPAGE的成果标明意图蛋白在上清和沉积中均自在表达，在上清中的蛋白含量远大于沉积中的蛋白含量，阐明诱导表达的蛋白大部分以可溶性蛋白的方式表达。
依据试剂盒可溶性蛋白纯化试剂盒的阐明书，对PnPR102重组蛋白进行纯化，当洗脱液含80%结合液及20%洗脱液时，纯化蛋白浓度最高，但纯度较低；而当洗脱液含40%结合液及60%洗脱液时，蛋白纯化纯度较高，但浓度不高（图5）。蛋白纯化实验作用较好，测定了纯化后蛋白液的浓度后，-80 ℃保存，进行下一步实验。
24纯化PnPR102重组蛋白抑菌实验选用三七根腐病典型病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans为测验菌，纸片法测验纯化的PnPR102重组蛋白的抗真菌活性，2个菌株经纯化PnPR102重组蛋白处理24 h后，均可见明晰的抑菌环，而对照未呈现抑菌圈（图6）。在腐皮镰刀菌F solani抑菌实验中，关于高浓度的PnPR102重组蛋白处理所构成的抑菌圈巨细显着大于低浓度重组蛋白处理。在人参锈腐病菌C destructans抑菌实验中，低浓度的PnPR102重组蛋白处理抑菌圈不显着（数据未表现），在高浓度PnPR102重组蛋白处理下构成了显着的抑菌圈。标明PnPR102重组纯化蛋白对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans有必定的抑制作用。
3评论
PR10是广泛存在于高等植物中的一类十分重要的病程相关蛋白，其不只参加植物对生物和非生物钳制的防御反响，对植物的成长发育也有必定的功用。三七是我国，特别是云南省重要的药材主栽种类，价值较高，因为遭到根腐病等常见病害的损害，长时间依靠农药等化学药品的操控，在必定程度上降低了三七的质量。因而，活跃发掘和研讨三七自身的抗病基因，可认为找出对病害抗性好种类供给研讨参阅。本研讨经过克隆三七病程相关蛋白10基因（PR10），与已发现的三七PnPR101基因是不同的2个三七PR10基因[14]，因而命名为PnPR102，丰厚了对三七PR10基因宗族的研讨。PnPR102基因包括一个典型的Bet v I型过敏源保存结构域，标明该蛋白参加防御反响（GO：0006952）和生物应激反响（GO：0009607）的生物学进程。PnPR102序列与已知的其他植物如人参、胡萝卜、香芹菜等的PR10序列具有必定的类似性，特别与人参的PR102序列类似度到达98%。endprint
本研讨的中心意图在于研讨PnPR102蛋白的抗根腐病病菌的作用，经过重组DNA技能，使意图基因在pET原核表达载体系统中凭借Ecoli宿主表达菌很多诱导了PnPR102蛋白的表达，经过优化表达条件，PnPR102蛋白能够在破碎细胞的上清和沉积中有较为抱负的表达量，为后续的研讨供给了较好的条件。从细胞上清中纯化收回得到了PnPR102重组蛋白，抑菌实验标明PnPR102重组蛋白对典型根腐病病菌腐皮镰刀菌F solani和人参锈腐病菌C destructans有必定的抑制作用，这与其他物种中发现的PR10蛋白具有体外抗菌活性的结论是共同的[6，9]，猜想该基因或许参加了三七抗根腐病的防御反响。
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[责任编辑吕冬梅]endprint