髓母细胞瘤电话素s 整合素α3在髓母细胞瘤干细胞中的表达及对侵袭效果的影响

王勇+王玉社+陈航

【摘要】 意图 研讨整合素α3在髓母细胞瘤干细胞中的表达及其对侵袭效果的影响。办法 运用免疫磁珠法（MACS）从髓母细胞瘤标本中取得CD133+和CD133-细胞， 经过免疫组化和实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测CD133+ 和CD133-两组细胞中整合素α3的表达， 运用transwell细胞侵袭试验调查运用整合素α3抗体和未运用整合素抗体对CD133+侵袭效果的影响。成果 整合素α3在CD133+组的表达显着高于CD133-组（P<0.01）；运用整合素α3单克隆抗体组穿膜细胞数目为（26.53±3.71）， 低于空白对照组的（54.76±6.27）（P<0.01）。定论 整合素α3在髓母细胞瘤干细胞的侵袭中起重要效果。

【关键词】 髓母细胞瘤；干细胞；整合素α3；侵袭

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.30.013

【Abstract】 Objective To research expression of integrin α3 in medulloblastoma stem cells and its influence on invasion effect. Methods Magnetic activated cell sorting （MACS） was applied to taken CD133+ and CD133- cells from medulloblastoma samples. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （PCR） were used to detect expression of integrin α3 in CD133+ and CD133- cells. Influence by application of integrin α3 antibody on CD133+ invasion effect was observed by transwell cell invasion assay. Results Expression of integrin α3 in CD133+ group was obviously higher than that in CD133- group （P<0.01）. Monoclonal antibody had lower transmembrane cell number by integrin α3 as （26.53±3.71） than （54.76±6.27） in the blank control group （P<0.01）. Conclusion Integrin α3 shows important effect in invasion of medulloblastoma stem cells.

【Key words】 Medulloblastoma； Stem cells； Integrin α3； Invasion

髓母细胞瘤是儿童最常见的脑恶性肿瘤， 简单复发， 一起易沿蛛网膜下腔播散搬运。肿瘤细胞的侵袭性成长是一个多进程的杂乱进程， 有多种生物化学因子参加其间[1， 2]。本研讨经过检测髓母细胞瘤干细胞中整合素α3的表达， 一起运用抗整合素单克隆抗体， 调查其对侵袭效果的影响。现陈述如下。

1 材料与办法

1. 1 材料 髓母细胞瘤干细胞取自2013年～2015年河南省人民医院神经外科手术标本。

1. 2 办法

1. 2. 1 髓母细胞瘤干细胞的培育和判定 肿瘤手术标本剪碎后胰蛋白酶消化， 吹打成单细胞悬液；过滤、离心搜集细胞， 培育于神经干细胞培育液中（含Neurobasal培育基、1：50 B27添加剂、20 μg/L成纤维细胞成长因子、20 μg/L表皮细胞成长因子）， 在37℃、 5%CO2细胞培育箱中培育， 培育所得细胞呈神经球状成长。

1. 2. 2 免疫磁珠法分选CD133+和CD133-细胞 运用免疫磁珠细胞分选试剂盒（Mihenyi Biotech公司）别离出CD133+和CD133-细胞， 并运用流式细胞分析仪进行纯度测定。

1. 2. 3 逆转录定量PCR（QRT-PCR）检测 QRT-PCR检测分选后 CD133+细胞、CD133-细胞中整合素α3的表达， 上游引物5-GGAAGGAACAAAGACAGGCAAAC-3， 下流引物5-GGTA GTGGTGAGTGAGAAGTGGC-3。

1. 2. 4 免疫组化 本试验选用免疫组化法， 整合素α3多克隆抗体购自武汉博士德公司， 作业浓度为1：100。

1. 2. 5 侵袭试验 将CD133+细胞分为两组进行侵袭试验， 一组参加抗整合素α3单克隆抗体（购自武汉博士德公司）， 浓度为100 μg/ml；另一组为空白对照组。将Transwell小室加在24孔板上， 上室进行铺胶， 每孔参加100 μl（每孔约含2×104 个细胞）无血清的细胞悬液， 下室参加500 μl含10% 胎牛血清的DMEM， 种板后置于培育箱培育24 h后， 取出上室， 弃掉上室中培育基， 多聚甲醛溶液固定， 结晶紫染色。倒置显微镜调查， 摄影计数。

1. 3 调查目标 调查CD133+ 和CD133-两组中整合素α3的表达、每个视界穿过小室聚碳酸酯膜的均匀细胞数目。

1. 4 统计学办法 选用SPSS18.0统计学软件对研讨数据进行统计分析。计量材料以均数±标准差（ x-±s）表明， 选用t查验。P<0.05表明差异具有统计学含义。

2 成果

2. 1 CD133+ 和CD133-两组中整合素α3的表达 QRT-PCR 检测成果显现， CD133+ 和CD133-两组中整合素α3mRNA相对表达量分别为（3.985±0.236）、（0.047±0.003）， 比较差异具有统计学含义（P<0.01）。免疫组化显现CD133+组中整合素α3高表达， 而CD133-组低表达。别的， 整合素α3阳性的干细胞首要聚居在血管周围。

2. 2 抗整合素单克隆抗体运用后对髓母细胞瘤干细胞侵袭才能的影响 Transwell侵袭试验成果显现， 运用整合素α3单克隆抗体组与空白对照组比较， 干细胞侵袭才能下降， 每个视界穿过小室聚碳酸酯膜的均匀细胞数目显着下降， 两组的细胞数目分别为（26.53±3.71）、（54.76±6.27）， 比较差异有统计学含义（P<0.01）。

3 评论

近年来， 越来越多的依据支撑肿瘤干细胞学说， 并以为肿瘤干细胞在肿瘤的发作、搬运、复发和对医治的反抗中发挥着重要效果。干细胞特征的保持与干细胞所在的微环境（Niche， 壁龛）有密切关系。干细胞与基底膜的粘附是干细胞保持其特性的基本条件。干细胞经过各种粘附分子介导与细胞外基质之间的粘附， 然后使干细胞定居于壁龛中。整合素作为一类重要的细胞外表受体， 是重要的粘附分子之一。干细胞首要经过表达整合素完成对基底膜各种成分的粘附。干细胞对基底膜的脱粘附是诱导干细胞脱离干细胞群进入分解周期的重要调控机制。

整合素在多种恶性肿瘤中的表达显着高于周围的癌旁安排， 而且与预后显着负相关， 阐明它在肿瘤的侵袭搬运中起着重要效果。但关于其在干细胞中的表达报导较少。本研讨经过免疫磁珠法分选出CD133+的干细胞和CD133-的细胞。然后运用免疫组化和QRT-PCR检测两组整合素α3的表达状况， 发现CD133+组显着高于 CD133-组（P<0.01）。Lathia等[3]发现整合素不仅在CD133+的肿瘤干细胞中高表达；而且在Olig2+的肿瘤干细胞中相同高表达。反过来， 他们搜集整合素阳性的肿瘤干细胞， 培育后能够在更高频率更短时刻构成肿瘤。

神经干细胞一个重要特征是它们集合在血管周围的壁龛内。本研讨证明了上述定论， 镜下发现整合素阳性的干细胞首要聚居在血管周围。Lathia等[3]还发现60%表达整合素α6的胶质母细胞瘤细胞坐落血管5 μm以内。而且经过免疫组化双染发现整合素和CD133+在血管周围区域联合表达。

正常状况下， 干细胞旅居在安排或器官特定的壁龛中， 损坏肿瘤干细胞寓居的壁龛能够消除肿瘤干细胞[4]。在本试验运用抗整合素单克隆抗体使粘附于基底膜的肿瘤干细胞脱离， 然后损坏了干细胞的壁龛。经过Transwell试验发现， 与对照组比较， 穿膜细胞数削减， 细胞的侵袭活动才能下降。

综上所述， 整合素在髓母细胞瘤干细胞中的高表达， 以及经过抗整合素单克隆抗体损坏肿瘤干细胞的壁龛， 可使干细胞侵袭才能下降。整合素可作为将来医治髓母细胞瘤的一个方向。

参考文献

[1] 王勇， 梁庆华， 史锡文. uPA和FAK在髓母细胞瘤中的表达及临床含义.我国有用医药， 2012， 7（20）：40-42.

[2] 王勇， 毛伯镛， 程雄伟， 等. uPA和KDR在髓母细胞瘤中的表达及含义.中华神经外科杂志， 2003， 19（2）：106-108.

[3] Lathia JD， Gallagher J， Heddleston JM， et al. Integrin alpha 6 regulates glioblastoma stem cells. Cell Stem Cell， 2010， 6（5）：421-432.

[4] Nakada M， Nambu E， Furuyama N， et al. Integrin α3 is overexpressed in glioma stem-like cells and promotes invasion. Br J Cancer， 2013， 108（12）：2516-2524.

[收稿日期：2016-10-25]