凋亡因子 凋亡相关因子XAF—1和XIAP的表达及与膀胱癌复发的相关性研讨
张庆德 蔡学辉 潘勇 姜文元 柳勇 吴永进 王健
[摘要] 意图 探討凋亡按捺蛋白XIAP和XIAP相关因子1（XAF-1）的表达及与膀胱癌复发的相关性。 办法 以第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组）和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）为研讨目标，对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱安排。选用免疫组化办法（SABC）检测XIAP和XAF-1在初发组、复发组、对照组中的表达水平，剖析与膀胱癌开展和复发的联系，一起剖析XIAP和XAF-1与肿瘤数目、是否肌层滋润、临床分期及恶性程度分级的相关性。 成果 在初发组与复发组中XIAP的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈正相关（P<0.05）；即XIAP在不同的临床分期、恶性程度分级的表达强度不同，分期越高，表达强度越强。在初发组与复发组中XAF-1的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈负相关（P<0.05），即XAF-1在不同的临床分期、恶性程度分级的表达强度不同，分期越高，表达强度越低。XIAP、XAF-1的表达强度在肿瘤数目、是否肌层滋润均无显着相关性（P>0.05）。对照组、初发组、复发组XIAP目标与XAF-1目标相关（P<0.01），呈负相关，XIAP目标越高，XAF-1目标相对低。 定论 XIAP反常高表达和XAF-1反常低表达或许在膀胱癌发病和病况开展中起重要效果，为膀胱癌的医治和判别预后供给了新思路。
[关键词] XIAP；XAF-1；膀胱癌；复发
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）06-0024-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of apoptosis related factors XAF-1 and XIAP and their correlation with bladder cancer recurrence. Methods 20 patients with recurrent bladder cancer in the first time（recurrent group） and 20 patients with primary bladder cancer（primary group） were selected as the study subjects. The control group consisted of 20 normal bladder tissues of patients with recurrent bladder cancer. The expression levels of XIAP and XAF-1 in primary， recurrent and control groups were detected by immunohistochemistry（SABC）， and their relationship with bladder cancer progression and relapse was analyzed. At the same time， the correlation between XIAP， XAF-1 and the number of tumors， whether myometrial invasion， clinical stage and grade of malignancy was analyzed. Results The expression level of XIAP was positively correlated with clinical stage and malignant grade in the primary group and the recurrent group（P<0.05）， that was， the expression level of XIAP in different clinical stages and malignant grade was different， and the higher the staging， the stronger the expression intensity. The expression intensity of XAF-1 in primary group and recurrent group was negatively correlated with clinical stage and malignant grade（P<0.05）， that was， the expression level of XAF-1 in different clinical stages and malignant grade was different， and the higher the staging， the weaker the expression intensity. The expression intensity of XIAP and XAF-1 was not significantly correlated with the number of tumors and myometrial invasion（P>0.05）. The levels of XIAP in control group， primary group and recurrent group were negatively correlated with XAF-1（P<0.01）. The higher the XIAP， the lower the XAF-1. Conclusion Abnormal high expression of XIAP and abnormal low expression of XAF-1 may play an important role in the pathogenesis and progression of bladder cancer and provide a new idea for the treatment and prognosis of bladder cancer.
[Key words] XIAP； XAF-1； Bladder cancer； Recurrence
凋亡具有重要的生理和病理含义，凋亡反常则会导致机体发作肿瘤[1]。凋亡按捺蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡按捺蛋白宗族（IAP宗族）。X染色体相关凋亡按捺蛋白（X chromosome-linked inhibitors of apotosis protein，XIAP）是IAP宗族中调理效果最强，也是研讨最广泛的凋亡按捺蛋白[2]。XIAP相关因子1（XIAP associate factor 1，XAF-1）是一个新近发现能够拮抗XIAP抗凋亡效果的蛋白，研讨提示XAF-1在介导肿瘤细胞凋亡受阻中具有重要效果，现在关于XIAP和XAF-1的表达及与膀胱癌复发性的研讨罕见报导，咱们使用免疫组化办法（SABC法）检测50名初发膀胱癌患者和2年后第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组），对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱安排。以复发组和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）、对照组为研讨目标，评论其与膀胱癌复发的相关性。现报导如下。
1 目标与办法
1.1 研讨目标
50例膀胱癌患者均为2012年2月～2014年10月经本院道德委员会同意的泌尿外科住院和门诊随访的患者，归入规范：（1）均为初发未医治膀胱癌患者并经膀胱镜活检或许手术标本证明为移性细胞癌，其他类型的癌除掉；（2）一切患者均行TUR-BT，术中因特殊状况改其他手术办法的除掉；（3）术后均行前期灌注：术后4～8周，表柔比星（常用剂量为每次30～50 mg）每周1次膀胱灌注，之后保持灌注：每月1次，保持6～12个月。改动医治计划者除掉；（4）均无手术禁忌证；（5）所选病例临床材料完整，2年内不复发的患者除掉；（6）标本：手术所取膀胱移行细胞癌标本，对照组取相应远离肿瘤（>5 cm）的正常安排标本，术中切除标本马上放入4%甲醛溶液中保存。以第一次复发的20例膀胱癌患者（复发组）和其对应的20例初发的膀胱癌患者（初发组）为研讨目标，对照组为20例复发的膀胱癌患者的正常膀胱安排。初发患者20例，男11例，女9例，年纪30～72岁，中位年纪56岁。病理分级：Low（G1）17例，High（G2-G3）3例。分期：T0-T1 16例，T2-T4 4例。非肌层滋润性膀胱癌（NMIBC）15例，肌层滋润性膀胱癌（MIBC）5例。肿瘤单发14例，肿瘤多发6例。复发患者20例，男11例，女9例，年纪32～74岁，中位年纪58岁。病理分级：Low（G1）13例，High（G2-G3）7例。分期：T0-T1 12例，T2-T4 8例。NMIBC 14例，MIBC 6例。肿瘤单发12例，肿瘤多发8例。
1.2 免疫组化染色法
XIAP山羊抗人多克隆抗体及免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），标本处理办法如下：新鲜标本经10%甲醛固定，浸蜡、包埋。惯例HE染色，进行病理学分级和安排学分型。免疫组化法按试剂盒说明书进行。一切的病理学目标均由病理科资深医生断定。
1.3 成果判别
免疫组化染色成果断定：XIAP表达状况成果判别：镜检可见标本细胞胞浆中呈现浅黄色至深棕色的颗粒，见图C、D、G、H、K、L。每张切片随机调查10个高倍镜视界（×400），关于胞质表达者，依据胞浆上色程度记分：0（无色，阴性），+（浅黄，弱阳性），++（棕黄，阳性），+++（棕褐，强阳性）；由固定的两名经验丰富病理科医生分别对免疫组化切片染色成果进行盲法阅片（未对此两名病理科医生奉告患者术后确诊状况）。XAF-1表达状况成果判别：镜检可见标本胞核中呈现浅黄色至深棕色的颗粒，见图A、B、E、F、I、J。成果判别对比XIAP成果判别办法：关于胞核表达者，上色程度评分办法为：对均匀10个显微镜镜下（×400）随机视界进行评分：0（0%），+1（1%～25%），+2（26%～50%），+3（>50%），依据阳性上色细胞占阴性肿瘤细胞总数断定百分比。然后将10个视界的积分之和除以10，成果四舍五入取整数作为胞核染色强度的最终积分，积分为四个分段（0分，阴性；+1～2分，弱阳性；+3～4分，阳性；+5～6 分，强阳性）。
1.4 计算学剖析
使用SPSS19.0计算软件收拾数据库，计量材料正态散布选用均数±规范差标明，肿瘤数目计量材料偏态散布选用中位数和四分位数距离标明，计数材料选用[n（%）]标明，选用χ2查验，相关剖析选用Spearman查验，P<0.05為差异有计算学含义。
2 成果
2.1 免疫组化成果
免疫组化试验成果显现各XIAP、XAF-1蛋白在膀胱癌细胞中表达程度及散布（封三图1～3），对照组（膀胱癌周围正常安排中的尿路上皮细胞）XIAP、XAF-1蛋白的表达程度及散布（封三图4）。试验显现：XIAP在膀胱癌中表现为显着胞质表达，XAF-1呈胞核表达。
2.2初发组、复发组与对照组XIAP、XAF-1目标表达强度与膀胱肿瘤参数及其他参数相关性
计数材料经χ2查验，是否底层滋润、恶性程度分级差异有计算学含义（P均<0.05），说明各组间存在差异。经Spearman相关剖析，对照组、初发组、复发组XIAP目标与XAF-1目标相联系数R为-0.349，P=0.004<0.01，呈负相关，XIAP目标越高，XAF-1目标相对低；XAF-1目标同理。见表1。
Spearman相关性剖析成果提示，初发组与复发组XIAP目标与临床分期相联系数为0.61（P<0.001），与恶性程度凹凸相联系数为0.55（P<0.001），呈正相关；XIAP目标越高，临床分期、恶性程度也越高。初发组与复发组XAF-1目标与临床分期相联系数为-0.34（P=0.03），与恶性程度凹凸相联系数为-0.37（P=0.02），呈负相关，XAF-1目标越高，临床分期、恶性程度也越低。见表2。
3评论
现代研讨证明，肿瘤与凋亡密切相关。XIAP是新近发现的IAP宗族的新成员，在细胞凋亡调控中起着重要效果[3]。有研讨提示XIAP或许在细胞的增殖进程和细胞向恶性转化进程中发挥重要效果[4]。XAF-1是XIAP负性调理因子之一[5]。研讨标明XAF-1是一种具有潜能的肿瘤按捺因子[6]。本研讨初发组与复发组中XIAP的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈正相关（表2），提示XIAP与肿瘤的开展有联系密切，XIAP的反常高表达有利于细胞逃离成长监控，然后促进细胞的反常增殖和恶性转化，促进膀胱癌的发作和开展。研讨发现XIAP按捺细胞凋亡的途径有多条，其一是经过Caspase途径按捺细胞凋亡，其二还经过NF-κB途径按捺细胞凋亡。XIAP还经过参加其他信号通路按捺细胞凋亡。国外还有研讨证明XIAP还经过调理线粒体膜通透性来增强细胞凋亡按捺，这种机制现已被开发用于癌症医治[7-9]。
Carsten Kempkensteffen等[10]以为XIAP在正常和恶性睾丸安排中遍及表达，在安排学亚组中XIAP mRNA水平没有显着差异。Shibata T等[11]以为XIAP表达水平在非肿瘤性胃黏膜和腺癌之间或在前期和晚期癌之间没有改动，以上均提示XIAP的表达安排特异性较强。而Kempkensteffen C等[12]以为睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）与正常睾丸安排比较，XAF-1和HtrA2表达水平随精原细胞瘤患者临床肿瘤分期的开展而逐步升高，其表达水平相关性强，提示不同安排、不同肿瘤XAF-1的表达水平不同，与肿瘤开展的正负相关性不同。
本研讨发现在初发组与复发组中XAF-1的表达强度与临床分期、恶性程度分级呈负相关（表2）。对照组、初发组、复发组XIAP与XAF-1呈负相关，XIAP目标越高，XAF-1目标相对低（表1）。现代肿瘤理论以为不改动基因序列，而经过本身化学修饰的办法从转录水平影响基因的表达、调控DNA功用，是肿瘤发作的重要机制，而甲基化研讨是最深化的。肿瘤学研讨还发现：（在人类基因组转录区，CpG彼此集合，称为CpG岛）基因发动子高度密布的CpG岛反常甲基化是导致肿瘤抑癌基因表达反常的内涵机制。而XAF-1的表达与许多基因的CpG岛反常甲基化有关。Lee等[13]报导，XAF-1基因发动子区域-20至-695位点的CpG悉数或部分位点的甲基化程度与XAF-1表达下降有关，并且与疾病开展相关，特别是膀胱癌的恶性程度。研讨發现XAF-1基因经过在其发动子区CpG的甲基化使转录缄默沉静，然后经过促进细胞凋亡危害细胞生机，有丝分裂灾变或细胞周期按捺，跟着XAF-1转录按捺程度的加重，使XAF-1蛋白表达削减，促凋亡才能不断下降，肿瘤细胞更易躲避凋亡而存活，进而促进膀胱癌病程的开展。因而，XAF-1发动子中的CpG甲基化代表触及XAF-1缄默沉静的首要表观遗传机制，并且因而对立细胞凋亡有按捺效果。XAF-1的表达触发XIAP从胞质到细胞核的从头散布[14，15]。XIAP经过与半胱天冬酶结兼并按捺其功用来按捺凋亡性细胞逝世。XAF-1拮抗XIAP活性，然后促进凋亡[16]。这标明缺少XAF-1的表达导致凋亡反常或许是膀胱癌发作的重要机制，并且与膀胱癌的病况开展具有显着的相关性。与文献报导XAF-1的丢掉与多种癌症中的恶性肿瘤开展有关[16]，与XAF-1水平在泌尿上皮癌细胞系中明显削减[13，16，17]共同，在胃癌中，XAF-1转录本水平的相对下降与肿瘤的阶段和等级相关，标明XAF-1的丢掉有助于肿瘤的发作[8]。因而能够预见进步XAF-1水平的办法能够添加凋亡易理性并为癌症医治供给别的的战略。XIAP的半胱天冬酶按捺活性遭到至少XIAP彼此效果蛋白XAF-1、Smac/DIABLO、Omi/HtrA2和热休克转录因子（HSF）1等的负调控[18，19]。除参加细胞凋亡调理外，XIAP也参加许多其他生物学重要的细胞活动，包含调理受体介导的信号转导和蛋白泛素化等。以上文献均提示XAF-1是凋亡促进进程的重要参加者之一。但是XIAP与XAF-1彼此效果是十分复杂的，其间的生物学效应和分子事情依然不能彻底了解，更深化的、具体的分子学机制需求更多试验进一步说明。
总归，本研讨成果标明：XIAP反常高表达和XAF-1反常低表达或许在膀胱癌发病和病况开展中起重要效果，这为临床医治和判别膀胱癌预后供给了新的思路，即按捺XIAP的表达和功用，一起康复XAF-1的表达和功用，有或许成为膀胱癌医治的一种新手法，监测XIAP和XAF-1对猜测膀胱肿瘤的开展有协助。
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（收稿日期：2017-11-23）