过氧化氢诱导细胞凋亡 隐丹参酮诱导乳腺癌 MDA—MB—231 细胞凋亡的研讨
周南阳+赵虹
[摘要] 意图 探討隐丹参酮对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响及其机制。 办法 用不同浓度的隐丹参酮处理MDA-MB-231细胞24 h。选用 MTT、流式细胞术检测不同浓度隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性、凋亡的影响。选用Western blot检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。 成果 与0 μmol/L对照组比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L隐丹参酮组MDA-MB-231细胞存活率显着下降，且呈剂量依靠（P<0.05）。流式细胞仪检测显现隐丹参酮在20 μmol/L浓度时MDA-MB-231细胞凋亡率为（6.34±0.52）%，与对照组（6.09±0.76）%比较无统计学差异（P>0.05）。在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时MDA-MB-231细胞凋亡率别离是（18.74±0.65）%、（28.04±3.08）%，与对照组比较有统计学差异（P<0.05），且两浓度组之间比较差异亦有统计学含义（P<0.05）。Western blot成果显现，与对照组比较，隐丹参酮在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时，MDA-MB-231细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达显着下调（P<0.05），一起，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达显着添加（P<0.05）。 定论 隐丹参酮可诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡，其机制或许与激活Bax、Caspase-3和按捺Bcl-2等凋亡调控基因有关。
[要害词] 隐丹参酮；乳腺癌；MDA-MB-231细胞；凋亡
[中图分类号] R273 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）34-0038-05
Study of cryptotanshinone inducing apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells
ZHOU Nanyang1 ZHAO Hong2
1.Department of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou 310008， China； 2.Department of Breast Surgery， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310006， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of cryptotanshinone on the apoptosis of breast cancer MDA-MB-231 cells and its mechanism. Methods MDA-MB-231 cells were treated with different concentrations of cryptotanshinone for 24h. The effects of different concentrations of cryptotanshinone on the activity and apoptosis of MDA-MB-231 cells were detected by MTT and flow cytometry. Western blot was used to detect the protein expressions of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in MDA-MB-231 cells. Results Compared with that of the 0 μmol/L control group， the survival rates of MDA-MB-231 cells in 10， 20， 40， 80 μmol/L cryptotanshinone groups were significantly decreased（P<0.05）. And the survival rate was dose-dependent.Flow cytometry showed that the apoptosis rate of MDA-MB-231 cells was（6.34±0.52）% at cryptotanshinone concentration of 20 μmol/L， which was not significantly different from that of the control group （6.09±0.76）% （P>0.05）. The apoptosis rates of MDA-MB-231 cells were （18.74±0.65）% and （28.04±3.08）% respectively at 40 μmol/L and 80 μmol/L， which were different from those of the control group（P<0.05）， and the difference between the two concentration groups was statistically significant（P<0.05）. Western blot results showed that anti-apoptotic protein Bcl-2 expression in MDA-MB-231 cells was significantly down-regulated at cryptotanshinone concentrations of 40 μmol/L and 80 μmol/L， compared with that of the control group（P<0.05）. Meanwhile， the expression of pro-apoptotic proteins Bax and Caspase-3 increased significantly（P<0.05）. Conclusion Cryptotanshinone can induce the apoptosis of triple negative MDA-MB-231 cells， which may be related to the activation of apoptosis regulatory genes including Bax，Caspase-3 and Bcl-2.endprint
[Key words] Cryptotanshinone； Breast cancer； MDA-MB-231 cells； Apoptosis
乳腺癌是女人最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年添加，现在居女人癌逝世率第一位[1]。其间，以雌激素、孕激素及人类表皮成长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）表达阴性的三阴乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）恶性程度最高，因其对内排泄医治和抗Her-2靶向医治不灵敏，故生存率比非三阴性乳腺癌差[2，3]。针对立三阴乳腺癌的新药研讨成为现在乳腺癌医治的要点之一。隐丹参酮（Cryptotanshinone）是从中药丹参根中提取别离的二萜醌类有用单体，具有抗炎、抗菌、抗动脉粥样硬化等多种生物学活性和药理效应[4，5]。近年来文献报导，隐丹参酮可有用按捺多种肿瘤细胞增殖、侵袭，诱导肿瘤细胞凋亡，按捺血管生成，然后发挥其抗肿瘤的效果[6，7]。现在，有关隐丹参酮对乳腺癌细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。本研讨以三阴乳腺癌 MDA-MB-231细胞为研讨目标，用不同浓度隐丹参酮干涉，检测其对细胞活性和凋亡的影响，检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达水平，然后调查隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，并开始探究其机制。
1 材料與办法
1.1 材料来历
乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国科学院上海生命科学研讨院细胞库，本试验室传代保存。胎牛血清和 RPMI 1640 培育基购自Hyclone 公司。隐丹参酮购自成都曼思特生物科技有限公司（纯度大于98%）（图1），将隐丹参酮溶于 DMSO配制成等20 mmol/L的储藏液，分装后于-20℃贮存；使用时用无血清 RPMI 1640 培育液稀释为10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的工作液，DMSO 终浓度为 0.1%，对照组为含0.1% DMSO的细胞培育液。兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin抗体和辣根过氧化物酶符号山羊抗兔 IgG购自 Cell Signaling Technology公司。Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自美国Bio-Rad公司。流式抗体 Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物。
1.2 办法
1.2.1 细胞培育 乳腺癌 MDA-MB-231 细胞在37℃，5% CO2条件下，惯例培育于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培育基。当细胞密度达 90%并处于对数成长期时，用 0.25%胰酶消化传代培育。
1.2.2 细胞活性检测 取对数成长期的MDA-MB-231细胞，接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，细胞数1×104/孔，每组设5个复孔。培育 24 h后，吸弃原培育液，各孔别离参加 200 μL 含有不同浓度隐丹参酮的工作液（0、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L），一起设调零孔。持续培育24 h后，使用 MTT 法在波长490 nm 处检测各组样品吸光度值（A490）。细胞存活率=（试验组A值-对照组A值）/（对照组A值-空白组A值）×100%，对照组界说为100%。试验重复3次。
1.2.3 细胞凋亡检测 取对数成长期的MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，3×105/孔，每组设3个复孔。培育24 h后，吸弃原培育液，以不同浓度隐丹参酮（0、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞。持续培育24 h后，搜集1×105细胞，参加500 μL Binding Buffer悬浮细胞，参加 5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide 混匀后，温室避光孵育染色10 min。用流式细胞仪进行检测。试验重复 3 次。
1.2.4 Western blot 检测蛋白表达 取对数成长期MDA-MB-231细胞，接种于6孔板，1×106/孔，待细胞融合至 80% 时，以不同浓度隐丹参酮（0、40 μmol/L、80 μmol/L）处理细胞。持续培育24 h，搜集细胞，4℃预冷的PBS洗刷3次，参加75 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，bradford法测蛋白质浓度。取 25 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE 电泳别离蛋白后搬运至 PVDF 膜，用5% BSA/TBST关闭液室温下关闭1 h，洗膜后参加抗Bcl-2、Bax、Caspase-3和 β-actin 一抗（1∶1 000稀释 ），4°C孵育过夜，TBST洗膜 3 次，参加二抗（1∶1 000稀释）室温下孵育2 h，TBST 洗膜 3 次，将化学发光增强液A和B等体积混匀涂改于PVDF膜上，用Bio-Rad凝胶成像体系获取图画。试验重复3次。
1.3 统计学办法
选用 SPSS 17.0 统计学软件剖析，计量材料以（x±s）标明，多组间比较选用单因素方差剖析，两两比较选用 Bonferroni 校对的t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响
本研讨用MTT法检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞活性的影响，成果显现，在隐丹参酮效果24 h后，与对照组（0 μmol/L）比较，10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L组MDA-MB-231细胞存活率别离为（77.07±0.83）%、（62.49±1.00）%、（49.41±0.48）%、（38.98±5.06）%。与对照组比较，各浓度组差异具有统计学含义（P<0.05），两两比较成果显现，各浓度之间差异有统计学含义（P<0.05），标明隐丹参酮可显着按捺MDA-MB-231细胞活性，且呈剂量依靠（图2）。endprint
2.2 隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
本研讨用Annexin V-FICT/PI双染流式细胞术检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞凋亡的影响，成果显现，隐丹参酮在20 μmol/L浓度时对MDA-MB-231细胞凋亡率为（6.34±0.52）%，与对照组（6.09±0.76）%比较无统计学差异；隐丹参酮在40 μmol/L、80 μmol/L浓度时對MDA-MB-231细胞凋亡率别离是（18.74± 0.65）%，（28.04±3.08）%。与对照组（6.09±0.76）%比较差异具有统计学含义（P<0.05），两浓度组之间差异有统计学含义（P<0.05），标明隐丹参酮浓度大于40 μmol/L时可诱导MDA-MB-231细胞搬迁，且呈剂量依靠（图3）。
2.3 隐丹参酮对立凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达的影响
本研讨用Western blot检测隐丹参酮对MDA-MB-231细胞抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达的影响。成果显现，在隐丹参酮效果24 h后，与对照组（0 μmol/L）比较，40 μmol/L、80 μmol/L组MDA-MB-231细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达显着下调，一起，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达显着添加（P<0.05），且两浓度之间差异有统计学含义（P<0.05）（图 4）。
3 评论
三阴性乳腺癌在临床医治中常随同易耐药、易复发、搬运率高级特色，是现在乳腺癌医治中的难题之一[8]。隐丹参酮是从中药丹参根中提取别离的二萜醌类有用单体，具有抗炎、抗菌、抗动脉粥样硬化等多种药理效应[4，5]。跟着研讨的深化，其抗肿瘤的特性也得到证明[6，7]。近年研讨发现，隐丹参酮可经过下调STAT3通路按捺肾细胞癌增殖，诱导细胞凋亡[9]。Kim EJ等[10]经过体表里试验研讨发现，隐丹参酮作为一种新的拓扑异构酶Ⅱα按捺剂，对前列腺癌PC-3细胞的成长具有显着的按捺效果，且对正常安排没有显着的细胞毒性。还有动物试验成果标明，在人肺癌裸鼠原位移植模型中，隐丹参酮能有用按捺肿瘤构成，诱导其凋亡，一起可改进机体情况[11]。因而，隐丹参酮抗肿瘤活性具有必定的研讨远景。本研讨前期研讨成果显现，隐丹参酮在体外可显着按捺三阴乳腺癌MDA-MB-231细胞中c-Src和FAK 蛋白的磷酸化，下调MMP2蛋白，然后按捺其搬迁和侵袭。本研讨成果标明，隐丹参酮可诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞凋亡，且呈剂量依靠性。Western blot成果标明隐丹参酮显着按捺 MDA-MB-231细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达，添加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达，开始提醒了隐丹参酮诱导乳腺癌 MDA-MB-231细胞凋亡的分子机制。
细胞凋亡是细胞受环境影响后，在基因编程调控下发作的细胞自主性逝世进程[12]。肿瘤细胞可经过激活或按捺凋亡相关信号通路，然后保持其不断增殖并防止发作凋亡[12]。其间，Caspase 蛋白酶级联反响、Bcl-2 宗族抗凋亡和促凋亡蛋白表达的改动与凋亡的发作密切相关[13]。Caspase-3，被称为“逝世履行蛋白酶”是Caspase 宗族中最重要的凋亡履行者之一，是多种凋亡途径的一起下流效应部分[13]。活化的 Caspase-3可直接剪切DNA 依靠性蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶，然后影响细胞DNA的仿制、转录及修复进程，终究导致细胞的凋亡[14]。临床研讨发现，维生素C和甲氨蝶呤联合医治可激活Caspase-3按捺三阴性乳腺癌细胞的成长[15]。本研讨发现浓度大于40 μmol/L隐丹参酮可显着添加MDA-MB-231细胞Caspase-3表达水平，且随浓度添加效果增强，提示隐丹参酮或许经过激活Caspase-3诱导MDA-MB-231 细胞凋亡。
Bcl-2宗族蛋白是细胞凋亡信号通路中要害的凋亡调理因子[16]。其间，Bcl-2是按捺凋亡效果发挥的首要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白，其基因定坐落18号染色体21区[17]。Bcl-2可经过按捺线粒体内细胞色素C和凋亡诱导因子AIF等促凋亡蛋白的开释阻挠凋亡的进程[17]。Bax是促凋亡的代表成员之一，其坐落19q13.3～q13.4区[18]。Bax在接收到凋亡信号影响被激活，移位并刺进线粒体外膜后构成Bax大孔道，损坏线粒体膜的完整性发挥促凋亡效果[18]。此外，Bcl-2和Bax可经过同源和异源性二聚体来调理细胞凋亡[19]。在正常情况下，Bcl-2和Bax在细胞中表达量相对安稳，而当Bcl-2在细胞内高表达时，Bax/Bax同源二聚体的很多解离，促进细胞呈现抗凋亡效果，然后引起肿瘤的发作[19]。研讨发现，人参皂苷可经过上调Bax/Bcl-2比值协同紫杉醇诱导三阴性乳腺癌细胞凋亡[20]。本研讨发现浓度大于40 μmol/L 隐丹参酮可按捺 MDA-MB-231 细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达，添加促凋亡蛋白Bax，上调Bax/Bcl-2比值，提示隐丹参酮促凋亡机制或许是经过下调Bcl-2、上调Bax，损坏线粒体膜完整性而促发。
综上所述，隐丹参酮可诱导三阴乳腺癌MDA-MB-231 细胞凋亡，其机制或许与激活Bax、Caspase-3和按捺Bcl-2等凋亡调控基因有关。本研讨为隐丹参酮应用于乳腺癌的医治积累了前期试验根底。可是，有关隐丹参酮对乳腺癌细胞其他凋亡调理蛋白表达的影响，其与化疗药物及靶向药物等医治手法的配伍协同效应，以及在动物模型上抗癌效应及机制有待进一步研讨。
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（收稿日期：2017-09-29）endprint