小鼠姜黄素的测定 姜黄素对H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤效果及机制研讨

刘碧霞　　章红燕

[摘要] 意图 评论姜黄素对 H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤效果及机制，为H22肝癌临床医治供应试验依据。办法 选用ICR小鼠接种H22瘤株、S180肉瘤株别离树立肿瘤模型，选用姜黄素进行干涉，清晰其抑瘤效果，分阳性对照组（CTX化疗组）、阴性对照组（生理盐水组）、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素高剂量组，每组12只。比照剖析医治组各组用药前后体重、抑瘤率的差异；动物处身后，取肿瘤安排，选用荧光定量RT-PCR测定肿瘤安排中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达。 成果 姜黄素对肝癌和肉瘤小鼠肿瘤成长按捺率为36.04%和41.27%，有显着的抑瘤效果。与模型组比较，给药组肿瘤安排NF-κB、CyclinD1、VEGF的表达水平下调，TGF-β1RⅡ的表达水平显着升高。 定论 姜黄素经过上调肿瘤安排TGF-β1RⅡ，下调NF-κB、CyclinD1、VEGF表

肝癌是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的病因及分子机制尚不彻底清楚，现在以为其发病是杂乱进程。近年来传统中医中药在肝癌归纳医治中有显着优势[1-3]。中医药医治与手术、放疗、化疗、免疫医治一道被称为当时针对恶性肿瘤的五大类医治。近几年来，从中药中寻觅结构新颖和效果共同的抗肿瘤活性成分或先导化合物是抗肿瘤药物研讨的一条重要途径。现在上市的抗肿瘤药许多来历于中药的提取及开发，包含紫杉来历的紫杉醇、多西紫杉醇，三尖杉来历的高三尖杉酯碱，人参来历的人参皂甙 Rg3 等。

姜黄，又叫黄姜、郁金、宝鼎香，为姜科植物姜黄的根茎，主产于浙江、福建、湖北、四川等地，为浙江省重要的本乡中药材。药理研讨标明，姜黄具有保肝、利胆、抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗艾滋病、抗生育、降血脂、抗病原微生物及抗病原虫、加速伤口愈合、抗骤变等效果。姜黄素首要是从姜科植物郁金中提取的一种化合物[4]。1985年Kuttan等[5]初次提出姜黄素具有抗肿瘤的效果，尔后有很多研讨进一步证明。吉鸿等[6]发现姜黄首要提取物姜黄素可经过按捺NF-γB-Snail信号途径来按捺乳腺癌细胞上皮间质转化进程（EMT），进而按捺其侵袭搬运才能。范德生等[7]发现用姜黄素处理鼻咽癌细胞系CNE-2Z后，肿瘤细胞增殖显着遭到按捺，一起细胞的侵袭和搬迁才能显着下降，其机制可能与姜黄素下调EGFR的表达有关。宛传丹等[8]发现姜黄素可有用按捺肝癌细胞的增殖，并可进一步诱导细胞凋亡。刘鹏等[9]经过对免疫按捺小鼠试验，发现姜黄素能够进步小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数，添加B细胞抗体发生才能，增强免疫按捺小鼠脾淋巴细胞的增值，对固有免疫和习惯免疫均有必定的增强效果。李然等[10]在药物毒性视点证明其安全性。介于其杰出的安全性及广泛的抗肿瘤效果，本研讨评论其抗肝癌效果及详细的分子机制。

1 材料与办法

1.1一般材料

1.1.1 细胞株及培育 S180瘤株、人肝癌HepG2细胞株引自我国科学院上海生物化学与细胞生物学研讨所细胞库，将H22肝癌细胞株，S180瘤株接种于100 mm细胞培育皿中，加培育液，于培育箱中培育，2～3 d传代1次，取對数成长期细胞进行研讨。

1.1.2 动物 ICR小鼠，SPF级，年纪：4～6周，体重18～22 g。浙江中医药大学试验动物中心，由常州卡文斯生物科技发展有限公司供应。试验动物出产许可证：SCXK（苏）2011-0003；试验动物运用许可证：SYXK（苏）2011-0036。

1.1.3 药物 姜黄素购自Sigma公司，分子质量368.38，以二甲基亚枫（DMSO）溶解，配制成100 mmol/L贮存液，运用时用含10%胎牛血清RPMI-1640培育基稀释到所需浓度，稀释后的DMSO终质量分数<5%，置于-20℃避光保存。打针用环磷酰胺：200 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.1.4 首要仪器 生物倒置显微镜（日本OLYMPUS IX51）；台式低速离心机（我国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2）；PCR仪器（美国ABI公司 9700型）。

1.2 试验办法

1.2.1 H22肝癌小鼠模型制备与分组 搜集培育的人肝癌细胞HepG-2悬液，浓度为1×107个/mL，以每只0.1 mL接种于60只体重（20±2）g ICR小鼠右侧腋窝皮下。接种后随机分为阴性对照组、姜黄素低剂量组（10 μmol/L）、姜黄素中剂量组（20 μmol/L）、姜黄素高剂量组（40 μmol/L）、阳性对照组、每组12只。

1.2.2 S180肉瘤小鼠模型制备与分组 取雄性60只ICR小鼠。无菌条件下取接种S180瘤株6～7 d的小鼠的腹水，以生理盐水稀释，调细胞浓度至1×107个/mL。按0.2 mL每只接种于小鼠前肢右腋皮下。接种后随机分为阴性对照组、姜黄素低剂量组（10 μmol/L）、姜黄素中剂量组（20 μmol/L）、姜黄素高剂量组（40 μmol/L）、阳性对照组（CTX组），每组12只。

1.2.3 给药 接种24 h后，阴性对照组灌胃生理盐水，剂量为0.2 mL/10 g，每天1次；姜黄素低、中、高浓度组别离给予10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L， 给药剂量0.2 mL/10 g，每天1次；阳性对照组腹腔打针CTX，20 mg/kg，每天1次。调查14 d停药，称重，处死并剥离皮下瘤体称重。

1.2.4 数据搜集 运用丈量瘤径的办法，动态调查受试样品的抗肿瘤效应。给药前各组鼠称重（第1次），并在给药2周后别离称重，给药完毕后，处死，手术剥取瘤块称重。

1.2.5 抑瘤研讨 抗肿瘤活性的点评目标：肿瘤成长按捺率（%），计算公式如下：

1.2.6 荧光定量RT-PCR测定肿瘤安排中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达的影响 （1）肿瘤安排总mRNA提取：按惯例进行。（2）反转录反响：按试剂盒阐明操作进行。反响条件：37℃ 60 min，95℃ 3 min。（3）实时荧光定量PCR扩增：按试剂盒阐明操作进行。反响条件：93℃→3 min变性，然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s，共做40个循环。（4）PCR引物序列规划。

1.3 统计学处理

使用SPSS（Staffstical Package for the Social Science）19.0对成果进行统计剖析，计数材料用均数±标准差（x±s）表明，多组间比较选用方差剖析，两组间比较用t查验，P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 姜黄素对荷H22肝癌瘤小鼠的抑瘤效果

姜黄素低、中、高剂量组对肝癌的肿瘤按捺率别离为12.15%、36.04%、19.84%、以中剂量组抑瘤效果最好，阳性对照组的肿瘤按捺率48.99%。姜黄素低、中、高剂量组和阳性对照组与阴性对照组瘤重比较均有显着性差异（P<0.01）。成果显现姜黄素对荷H22肝癌小鼠的肿瘤成长都有显着的按捺效果，见表1，图1。

2.2 姜黄素对荷S180肉瘤小鼠的抑瘤效果

與阴性对照组比较，姜黄素对荷S180肉瘤小鼠的肿瘤成长都有显着的按捺效果，其间低、中、高剂量组的抑瘤率别离为34.13%、41.27%、22.23%，给药组以中剂量抑瘤效果最好，CTX化疗组的抑瘤率55.56%。与阴性对照组比较，姜黄素低、中剂量组瘤重，均有显着差异（P<0.05）；CTX组的瘤重有十分显着差异（P<0.01）。见表2，图1。

2.3荧光定量成果

2.3.1 TGF-β1RⅡ荧光定量成果 与阴性对照组比较，中、高剂量姜黄素组和CTX组的TGF-β1RⅡ的表达水平显着升高，差异有统计学含义（P<0.01）；低剂量组TGF-β1RⅡ的表达水平略高，但无显着性差异；与CTX化疗组比较，中、高剂量姜黄素组和CTX组的TGF-β1RⅡ表达水平显着升高。

2.3.2 NF-κB荧光定量成果 与生理盐水比较，低、中、高剂量姜黄素组和阳性对照组（CTX）NF-κB的表达水平均有显着下降，且均有显着差异（P<0.01），其间以高剂量的姜黄素组下降水平最为显着。与CTX化疗组比较，高剂量组更有显着的效果趋势，成果有显着性差异（P<0.01）。见表4。

2.3.3 VEGF荧光定量成果 与阴性对照组比较（生理盐水），低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组（CTX）VEGF的表达水平有显着下降，有统计学差异（P<0.01）；与CTX化疗组比较，高剂量组无显着性差异（P>0.05），见表5。

2.3.4 CyclinD1荧光定量成果 与阴性对照组比较，高剂量组差异十分显着（P<0.01）；与阴性对照组比较，低剂量组、中剂量组和CTX化疗组有显着差（P<0.05）。见表6。

3评论

姜黄素是从中药姜黄、郁金、莪术、菖蒲等植物的根茎中提取的一种天然黄色酚类色素，其抗肿瘤效应近年来备受重视，有研讨证明姜黄素有切当的抗肿瘤、抗氧化、抗搬运、抗血管生成等效果[11]。姜黄素因其广泛的药理效果，在我国的传统医学中被广泛使用；而在现代医学中，姜黄素俨然成为研讨的热门。因其诱导细胞凋亡、按捺肿瘤增殖、侵袭搬运的抗癌效果和反转耐药性，且毒副效果小、安全性高[12-16]，因而姜黄素是一种具有远景的抗癌药物，但其抗癌效果的更详细的机制需进一步研讨。现在已发现姜黄素对多种恶性肿瘤如乳腺癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、结肠癌、胃癌[17]等均有按捺成长的作 用，美国国立肿瘤所已将其列为第三代癌化学防备药[18，19]，但其效果机制及效果还需进一步研讨证明。很多研讨证明姜黄素具有广泛的生理活性效果，不但能维护受损的正常细胞，也能按捺肿瘤细胞的增殖，在抗肿瘤药物中比较有发展远景，但其效果因口服吸收率低而遭到限制[20-21]。这就要求咱们也要不断发现姜黄素中更易于吸收、更有用的成分。信任在未来的研讨中，经过联合药物医治、基因医治、分子靶向医治可进一步进步恶性肿瘤医治水平。

本项目经过姜黄素干涉移植瘤模型，进行体内抑瘤效果研讨；采PCR检测肿瘤安排TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达的水平。本研讨完成了既定的研讨内容，取得了预期的研讨成果：①清晰姜黄素对H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠肿瘤的按捺效果研讨；②清晰姜黄素对H22肝癌腹水瘤小鼠的生计时刻的延伸效果；③清晰姜黄素对肿瘤安排TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表达影响。

国内外在抗肿瘤药物挑选进程中一般挑选各种体型实肿瘤，这类肿瘤成长速度快，增殖比率高，体积倍增时刻短。肿瘤体积和肿瘤体重是点评药物抗肿瘤活性的重要目标，给药后，各组小鼠肿瘤持续增长。给药一周后给药组与CTX组比较，呈现显着性差异（P<0.01）。

依据国家新药研讨规则，当按捺率>30%，差异有统计学含义，则鉴定该受试药物有必定的抗胖瘤活性，可见，本研讨的姜黄素具有杰出的抗肝癌异种移植瘤活性。

肿瘤的成长进程中，机体内血液对养分的供应才能是影响肿瘤成长以及荷瘤机体保持正常生理功用的中药影响要素。红细胞是外周血中起到运送氧气和二氧化碳的效果，血红蛋白是红细胞中结合氧气和二氧化碳的活性成分，白细胞在机体中起到防护和免疫功用，淋巴细胞占白细胞的20%～30%，分为T细胞、B细胞、NK细胞等不同类型，别离起到细胞免疫和体液免疫功用，血小板在机体的炎症进程中起到必定效果。血相的改变能够在必定含义上反映机体功用是否正常。本试验后续还将进一步展开研讨姜黄素对移植瘤小鼠的脾脏和血小板、血红蛋白、淋巴细胞等血细胞的影响，点评抗癌扶正协议方对机体的不良反响，此外，还从增效减毒视点评论姜黄素是否具有反转或缓解CTX等化疗药物的骨髓按捺，削减化疗药物对机体的危害效果。

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（收稿日期：2016-12-06）