大鼠脑缺血再灌注模型 大鼠肺缺血再灌注损害中阿米洛利的效果机制剖析

刘伟存

[摘要]意图 评论大鼠肺缺血再灌注损害中阿米洛利的效果机制。办法 挑选雄性试验大鼠72只作为研讨目标，随机分红三组，每组24只，分别为IR组（缺血再灌注）、假手术组（C组）、阿米洛利组（A组），分别在缺血45 min、再灌注60 min和120 min 3个不一起点将各组试验大鼠麻醉处身后取血浆和右肺安排，并对其进行检测。成果 IR组再灌注60、120 min时，丙二醛（MDA）、凋亡指数（AI）较假手术组均有显着升高，阿米洛利组在给予药物后，MDA、AI与IR组比较均有显着下降（P<0.05）。与假手术组比较，IR组各个时点的肺安排湿/干质量比（W/D）和髓过氧化物酶（MPO）活性均显着增高（P<0.05），而阿米洛利给药后肺安排W/D和MPO活性则显着下降。定论 阿米洛利对肺缺血再灌注损害具有很强的维护效果，这可能是通过削减钙离子，然后铲除体内过量的氧自由基，到达按捺中性粒细胞滋润和削减细胞凋亡的意图。

[要害词]肺缺血再灌注损害；阿米洛利；氧自由基

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）3（b）-0021-03

Analysis on mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury

LIU Wei-cun

Department of Respiration，Kailuan General Hospital of Tangshan City in Hebei Province，Tangshan 063000，China

[Abstract]Objective To explore the mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury.Methods Seventy-two experimental male rats were selected and randomly divided into the IR group （the ischemia reperfusion group），the sham operation group （group C） and the Amiloride group （group A），24 rats in each group.After 45 min ischemia，60 min reperfusion and 120 min，rats in each group were anesthetized and killed，then plasma and right lung tissues were taken and detected.Results At 60 and 120 min reperfusion，malondialdehyde （MDA），apoptosis index （AI） in the IR group were significantly higher than those in the sham operation group.The Amiloride group was given drugs，MDA and AI were significantly lower，compared with the IR group （P<0.05）.Compared with the sham operation group，the lung wet/dry weight ratio （W/D） and myeloperoxidase （MPO） activity in the IR group at each time point were significantly increased （P<0.05），while Amiloride after administration，the W/D in lung tissue and MPO activity decreased significantly.Conclusion Amiloride on lung ischemia reperfusion injury has a strong protective effect，this may be by reducing calcium ion，so as to remove the body of excess oxygen free radicals and inhibition of neutrophil infiltration and reduce cell apoptosis of purpose.

[Key words]Lung ischemia-reperfusion injury；Amiloride；Oxygen free radicals

近幾年，由于药物和医术的精进使得患者心肺复苏、肺栓塞和心脏转流等都得到了改进，可是依然有影响要素，其间最重要的就是肺缺血再灌注损害[1]。阿米洛利是一种交流按捺剂，其首要是交流Na+/H+，国外许多文献中都提到了交流剂在心肌缺血再灌注损害中的效果，其首要效果就是可以起到抗氧化和抗炎的效果，但在肺缺血再灌注损害中是否有必定的维护效果现在没有相关试验和文献的印证[2]。本研讨对树立肺缺血再灌注大鼠进行模型缔造，旨在研讨阿米洛利在肺缺血再灌注方面的相关效果。

1材料与办法

1.1试验药品与试剂

阿米洛利粉剂购自美国Sigma公司；肝素钠打针液购自上海生物化学试剂有限公司；丙二醛（MDA）试剂盒和髓过氧化物酶（MPO）试剂盒购自南京生物工程研讨所；戊巴比妥钠打针液购自上海试剂三厂；凋亡检测试剂盒购自北京生物有限技能公司。

1.2试验动物与分组

72只健康雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠由华北理工大学试验动物中心供给，体重180～220 g，动物出产合格证号为SCXK冀20061026-0001795。给予充沛饲料和饮水1周后进行试验。SD大鼠随机分为三组，每组24只。IR组（缺血再灌注）：先开胸游离右肺门，然后进行夹闭隔绝，之后持续完结灌注。假手术组（C组）：先开胸游离右肺门后，可是对其不进行夹闭隔绝。阿米洛利组（A组）：运用5 mg/（kg·d）的阿米洛利接连灌胃，时刻为1周，1周之后进行手术，剩下操作和IR组共同，无差异[3]。IR组和C组在相一起刻点内注入等量的生理盐水。

1.3大鼠模型的树立

挑选健康的SD大鼠（由华北理工大学试验动物中心供给），腹腔打针3%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对其进行麻醉。仰卧位固定，将器官切开后进行插管，然后衔接动物呼吸机，协助大鼠通气，动物呼吸机的设置要求：呼吸频率60次/min，在经胸骨右边第3～5肋之间开胸，游离右肺门，穿入手术线，等候5 min，然后夹闭45 min，之后建成模型[4]。

1.4标本搜集及检测

缺血45 min及再灌注60 min和120 min后搜集全血，3000 r/min离心10 min取上清，搜集新鲜右肺安排，-80℃保存备用。

1.4.1血清MDA含量测定 腹主动脉抽血3 ml，3000 r/min离心10 min，别离血清用硫代巴比妥酸（thiobarbituric aci，TBAd）法对血清中的MDA进行检测。

1.4.2肺安排MPO测定 获取右肺上叶相同部位肺安排1 g，获得之后制备成匀浆，最终把制备好的匀浆进行离心，离心之后取上清液用比色法测MPO。

1.4.3对肺安排湿/干重比值（W/D）进行测定 获取大鼠1 g右肺中叶安排，运用剖析天平进行称量，称量得到的质量称为湿质量，然后将其放在70℃电热恒温进行枯燥，枯燥之后得到的质量称为干质量，其间湿质量和干质量的份额是W/D[5]。

1.4.4肺安排细胞凋亡指数（AI）的检测 获取一小块右肺中叶进行固定，固定液选用10%的甲醛溶液，固定之后将其运用惯例白腊进行包埋，对大鼠右侧肺中叶的凋亡细胞进行定量检测。对细胞进行染色，细胞核染色之后呈现棕黄色，也是阳性细胞，除掉细胞核之后，还会有部分细胞质也会上色显现为黄色[6]。一些细胞质由于细胞核DNA碎片漏出导致呈现阳性着染。对切片进行调查，调查运用东西是切片光镜。

1.4.5病理查看 获取必定量的安排块，以10%的甲醛溶液进行固定后再进行包埋，切片，HE染色，最终在光镜下调查切片的改变。

1.5统计学办法

选用SPSS 20.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，两组间比较选用单要素方差剖析（one-way ANOVA），以P<0.05为差异有统计学含义。

2成果

2.1血浆MDA和肺AI在不一起点的改变状况

各组不同灌注时刻点的MDA和AI值比较，差异无统计学含义（P>0.05）；各组缺血45 min时的MDA、AI比较，差异无统计学含义（P>0.05）。IR组灌注60、120 min时的MDA、AI显着提高，且显着高于A组，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。

2.2肺安排W/D和MPO活性在不一起点的改变状况

各组内不同灌注时刻点上的肺安排W/D和MPO活性比较，差异无统计学含义（P>0.05）；在不同灌注时点，IR组与A组的肺安排W/D和MPO活性显着高于C组，差异有统计学含义（P<0.05），且IR组的肺安排W/D和MPO活性顯著高于A组，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。

2.3肺安排经病理学验证状况剖析

正常对照组的肺安排形状无任何显着改变，然后肺泡腔中会变得壁薄，无充血、水肿等状况。缺血再灌注发作45 min之后，就会呈现一些症状，首要是血管呈现充血，血管呈现充血之后，肺泡之间会发生炎性细胞，炎性细胞增多，细胞的损害程度也会加剧。

3评论

肺缺血再灌注损害的病理原因十分复杂，现在尚不清晰，研讨显现，氧自由基增多，钙离子量也变多，炎症细胞也增多，这些物质增多之后就会集合在一起，然后形成细胞凋亡，这些在肺缺血再灌注损害的开展过程中起着十分要害的效果[7]，因而部分学者以为可以首要在这几个方面进行干涉，通过这些干涉办法试验对肺缺血再灌注损害的维护[8]。

器官缺血呈现再灌注损害的重要要素是呈现氧自由基，氧自由基可以分化患者体内细胞间质的酶和胶原，使得安排器官遭到极大损害，MDA是氧自由基在进犯其他安排时发生的产品[9]，其含量可以直接决议到体内氧化负电荷的巨细，是判别发生氧自由基和安排遭到损害的首要目标，在试验过程中也能调查到。在IR组中，灌注时刻越长，LVIDA值越大，提示肺缺血再灌注损害呈现在体内可以损坏氧自由基，使得氧自由基平衡完全被损坏，添加氧自由基，诱发肺水肿和出血症。打针阿米洛利之后，MDA尽管也增多，可是添加的起伏没有IR组大，其下降效果也比较显着，提示阿米洛利具有很强的抗氧化才能，按捺自由基发生，削减肺缺血再灌注损害。

肺缺血再灌注损害状况的呈现和持续开展与中性粒细胞的激活和集合有着十分严密的联络[10]。呈现这种状况之后，通过呼吸效果释放出极多的氧自由基和蛋白水解酶，呈现的蛋白水解酶会损害肺血管安排和肺血管安排周围的器官，使得肺泡中的上皮细胞遭到损害。MPO是一种特异性酶，并且仍是一种中性粒细胞，其含量可以用中性粒细胞来测定。试验成果显现，打针阿米洛利之后，MPO量显着下降，提示打针阿米洛利可以有用削弱肺缺血再灌注损害时中性粒细胞的集合状况。

文献显现，细胞凋亡情況首要和缺血灌注损害有联系，当处于肺缺血再灌注损害状况下，患者体内会快速呈现很多的氧自由基和钙离子，这两种物质添加，细胞凋亡状况就会加剧[11]。本研讨成果显现，在缺血状况呈现多于30 min时，IR组与C组比较，差异无统计学含义；跟着灌注时刻的延伸，IR组内AI会快速增长，2 h到达最高值，这一成果和国内相关报导的内容共同。本研讨成果还显现，A组也升高，可是和IR组比较，数值仍是比较低，提示阿米洛利可以按捺肺缺血再灌注损害，减轻细胞凋亡状况，削减患者损害状况。

Na+/H+交流体归于一种按捺交流体，也称为NHE（Na+/H+ exchanger），在缺血灌注中体现出了阳离子的效果，标明在患者处于一种缺血状况时，患者体内的酸中毒状况会逐步加剧，随机NHE也会被激活[12]。可是在血液转运过程中却由于细胞呈现酸中毒状况而被按捺开展，当再次灌注之后，患者体内的血流会康复正常，细胞中毒状况也会得到改进，纠正细胞内酸中毒，并且还能集合钠离子[13]。这是由于ATP量开端削减，Na泵不能扫除钠离子，使得Na+/Ca2+交流体从反方向开端转出，转出钠离子的一起还会摄入钙离子，使得钙过量，由此形成了氧自由基增多、呈现多种炎症反应和患者体内细胞凋亡状况，然后加剧了患者的病症。阿米洛利是一种按捺剂，归于Na+/H+交流按捺剂，首要效果是估测患者体内的氧自由基是否得到按捺，患者细胞凋亡状况是否得到改进[14]。

现在点评肺水含量和微血管损害的医治是肺安排W/D，本研讨首要是对IR组灌入W/D，灌入之后其功能仍是十分高，提示阿米洛利关于干涉患者体内的病症是十分有效果的；一起，也在查看的切片中调查到患者打针阿米洛利之后肺水肿和体内炎症的改变状况，和IR组比较，患者的症状得到了显着的改进，提示阿米洛利的效果是铲除患者体内的氧自由基，然后从底子削减患者体内的中性粒细胞[15]。

综上所述，阿米洛利对肺缺血再灌注损害有着很强的维护效果，这可能与其按捺效果有关，由此来削减钙离子，继而削减人体内分化出的氧自由基，完成按捺患者体内中性颗粒细胞的滋润和削减人体内细胞的凋亡。

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（收稿日期：2017-12-15 本文修改：祁海文）