颅脑损害做高压氧 高压氧及Notch信号阻断剂对大鼠颅脑损害后海马区神经干细胞增殖分解的影响
杨永凯+张帆+韦浩
[摘要]意图 调查高压氧及Notch信号阻断剂（DAPT）对大鼠颅脑损害后内源性神经干细胞增殖分解的影响。办法 100只成年健康Wistar大鼠随机均匀分为假手术组、颅脑损害组、DAPT{N-[N-（3，5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）]-Sphenylglycinet-butylester}组、高压氧组及二甲基亚砜（DMSO）组，运用改进的自在落体办法制备脑损害模型，用免疫荧光双符号染色法调查伤后7、14、21 d及28 d大鼠海马区神经干细胞增殖分解。成果 颅脑损害组、DAPT和高压氧组海马区BrdU/nestin双标阳性细胞数，在伤后7 d为（14.2±1.3）、（11.4±1.7）个和（22.3±1.5）个，在伤后14 d为（9.6±0.7）、（6.9±2.1）个和（13.8±1.4）个，在伤后7 d较伤后14 d显着增多（P<0.05）；与颅脑损害组比较，DAPT组在伤后7 d及14 d双标阳性的细胞数显着削减（P<0.05）；高压氧组在伤后7 d及14 d双标阳性的细胞数显着增多（P<0.05）。定论 高压氧能促进内源性神经干细胞增殖分解，Notch信号阻断剂按捺了内源性神经干细胞增殖分解。
[关键词]高压氧；颅脑损害；神经干细胞；Notch通路；增殖分解
[中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）10（a）-0007-04
[Abstract]Objective To observe the effects of hyperbaric oxygen therapy and DAPT on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Methods 100 adult Wistar rats were randomly divided into sham-operation group，traumatic brain injury group，DAPT group，hyperbaric oxygen therapy group and DMSO group.Animal models of craniocerebral trauma were made using the improved free-fall method in the rats.The proliferation and differentiation of neural stem cells of the DG brain tissue was detected by BrdU labeling fluorescence immunocytochemistry at the 7，14，21 d and 28 d after injury.Results The BrdU and nestin positive cells of the traumatic brain injury group，DAPT group and hyperbaric oxygen therapy group began to increase from the 7 d（14.2±1.3，11.4±1.7，22.3±1.5） to the 14 d after injury （9.6±0.7，6.9±2.1，13.8±1.4）.Compared with the 14 d，the BrdU and nestin positive cells significantly increased 7 d after injury （P<0.05）.Compared with the traumatic brain injury group，the BrdU and nestin positive cells significantly decreased in the DAPT group 7 d and 14 d after injury （P<0.05）.Compared with the traumatic brain injury group，the BrdU and nestin positive cells significantly increased in the hyperbaric oxygen therapy group 7 d and 14 d after injury （P<0.05）.Conclusion Hyperbaric oxygen therapy can enhance the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.Notch signal channel blocker can restrain the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells after traumatic brain injury.
[Key words] Hyperbaric oxygen；Traumatic brain injury；Neural stem cells；Notch signal channel；Proliferation and differentiation
急性顱脑损害是神经外科的常见疾病，其致死率、致残率高，现在医治颅脑损害的办法中传统手术及药物的医治效果仍不尽满足，因而要寻觅其它有用的医治办法。干细胞医治是现在以为对颅脑损害患者比较有用的医治办法。近年来研讨发现，内源性神经干细胞毕生存在于侧脑室室管膜下区（subventricular zone，SVZ）和海马齿状回（dentate gyrus，DG）等脑内某些特定的区域。脑损害后可诱导内源性神经干细胞开端增殖、分解来进行修正[1-2]。Urrea等[3]研讨标明，脑外伤后海马齿状回内神经干细胞增殖在伤后前期即开端增殖，于2～3 d时到达顶峰。可是颅脑损害后内源性神经干细胞增殖分解才能非常有限，远不能到达临床恢复的要求。因而，研讨怎么促进内源性神经干细胞增殖分解，将为内源性神经干细胞医治带来宽广的远景。endprint
高压氧是现在医治颅脑损害比较有用的医治办法，国内很多临床报导也标明高压氧能够下降中枢神经损害的伤残率和病死率。别的国内潘长福等[4]试验显现小鼠颅脑损害后海马区Notch1及Hes1 mRNA显着增高，估测以为Notch信号激活或许与伤后神经干细胞增殖分解有关，因而本研讨估测高压氧能够经过Notch信号促进颅脑损害大鼠神经干细胞的增殖与分解。本研讨选用大鼠颅脑损害模型，用高压氧及Notch信号阻断剂DAPT{N-[N-（3，5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）]–Sphenylglycinet-butylester}干涉颅脑损害后大鼠，调查海马区内源性神经干细胞增殖分解状况，为高压氧医治颅脑损害供给理论依据。
1目标与办法
1.1目标
健康成年雄性清洁级Wistar大鼠100只，鼠龄3～4个月，体重250～300 g，由上海斯莱克试验动物有限责任公司供给，动物养殖温度20～24 ℃，12 h后明/暗循环，正常饮食，自在饮水。选用完全随机设计将大鼠分为5个组，别离为假手术组、颅脑损害组、DAPT组、高压氧组及DMSO溶剂组，每组各20只。
1.2首要试剂及仪器
DAPT购自美国Calbiochem 公司；DMSO购自美国SIGMA公司；颅脑定位仪（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；-80℃低温冰箱（美国Thermo公司）；SHC2600/7500-8型医用空气加压氧舱（上海七零一所杨园高压氧舱有限公司）。
1.3大鼠颅脑损害模型的制造
运用Feeney′s自在落体硬膜外碰击办法[5]树立大鼠颅脑损害模型，具体办法：损害设备由底板、固定支架、笔直导杆、下落击锤和聚乙烯碰击圆锥组成。碰击圆锥头端直径4 mm，高2.5 mm。用10%水合氯醛（0.4 ml/l00 g体重）腹腔内打针麻醉大鼠后，将其头部固定于立体定向仪上，剪去颅顶部皮裘，消毒皮肤后，沿中线右侧切开头皮，别离骨膜，用磨钻于中线旁2 mm，紧挨冠状缝后开直径5 mm的圆形窗，硬膜坚持完好。依据改进神经功用损害评分（modified neurological severity score，mNSS），大鼠中型颅脑损害的致伤冲击力为400 g·cm，用20 g砝码于20 cm高处经过金属导杆掉落，碰击置于硬膜上的圆锥上致中型颅脑损害，用骨腊关闭骨窗，缝合头皮，置鼠笼喂食。
mNSS经过运动试验、感觉试验、平衡木试验等反射丧失和不正常运动，归纳点评神经系统损害的严峻程度，是现在运用较广泛的脑损害后神经运动感觉功用的评价办法。其分数越低，标明神经运动感觉功用越挨近正常，评分标准拜见[6]。运用mNSS评分对大鼠颅脑损害模型进行判定，使大鼠具有相同的颅脑损害程度，本试验将评分为7～12分的中型颅脑损害大鼠列为研讨目标。
1.4给药及高压氧医治办法
①假手术组：仅切开头皮和颅骨开窗而不致损害脑安排；②颅脑损害组：按颅脑损害模型办法树立；③DAPT组：DAPT{N-[N-（3，5-Difluorophenacetyl-L-alanyl）]–Sphenylglycinet-butylester}为γ排泄酶按捺剂，是特异性的Notch信号阻断剂，溶于二甲基亚砜（DMSO）溶剂中坚持稳定，颅脑损害模型成功后腹腔打针DAPT，每次腹腔打针100 mg/kg体重[7]，隔日打针1次，接连28 d。④高压氧组：大鼠颅脑损害模型成功后3 h内进行高压氧医治，先用纯氧充沛洗舱10 min后，在20 min内匀速加压至2.0 ATA（0.2 MPa）稳压60 min，其间用纯氧通风10 min，舱内氧浓度>96%。稳压完毕后用20 min匀速减压至常压出舱。每天1次，共28 d。⑤DMSO溶剂组：依照与DAPT等体积腹腔打针颅脑损害大鼠。以上5组依据颅脑损害后处死动物的时刻（颅脑损害后7、14、21、28 d）随机分为4个亚组，每个亚组5只大鼠。
1.5 BrdU符号及安排免疫荧光双符号染色
5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），是一种嘧啶脱氧核苷类似物，在DNA组成期（S期），替代胸腺嘧啶掺入，符号重生细胞，可判别分解细胞是否来源于神经干细胞（NSCs），各组干涉后别离于颅脑损害后7、14、21 d及28 d处死大鼠，处死前2 d开端腹腔打针BrdU（50 mg/kg）每天2次，每次距离8 h。取脑标本时行4%多聚甲醛灌流后，再将脑置于4%多聚甲醛中浸置4～6 h后，取海马齿状回脑安排用PBS漂洗，经乙醇惯例脱水，二甲苯透明后，浸蜡包埋，接连5 μm厚切片，安排切片按免疫安排化学染色操作进程完成后运用激光共聚焦显微镜收集试验成果。参照Kuhn等[8-9]办法，核算双标阳性细胞数，每个亚组5只大鼠，每只大鼠取非接连的3张切片，每张切片选取2个视界计数细胞。
1.6统计学办法
选用SPSS 18.0统计学软件进行数据剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，多组间比较选用单因素方差剖析，组间两两比较选用SNK-q查验；以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
在激光共聚焦显微镜下调查，在BrdU/nestin荧光染色切片中，可见BrdU阳性细胞由TRITC符号为赤色，神经元特异性抗原nestin陽性细胞由FITC符号为绿色，BrdU/nestin阳性双标细胞显现为黄色。检测成果显现，假手术组在伤后各时刻点海马区均没有发现BrdU/nestin双标的阳性细胞；在伤后7 d及14 d颅脑损害组、DAPT组和高压氧组BrdU/nestin双标阳性的细胞数显着增多，与颅脑损害组比较，高压氧组双标阳性的细胞数显着增多（P<0.05），DAPT组双标阳性的细胞数显着削减（P<0.05），DMSO溶剂组对大鼠海马区神经干细胞增殖影响不大。且颅脑损害组、DAPT组、高压氧组双标阳性的细胞数在伤后7 d较伤后14 d显着增多（P<0.05）（表1）。endprint
3评论
BrdU作为标志物能够符号活泼的增殖细胞，但不能独自反映神经干细胞的增殖，nestin是一个广泛用于辨认神经干细胞的符号，免疫荧光BrdU/nestin双标阳性细胞能够反映新增殖的内源性神经干细胞。本试验用高压氧及DAPT干涉颅脑损害大鼠后，与颅脑损害组比较，在伤后7 d及14 d高压氧组双标阳性的细胞数显着增多，提示高压氧促进大鼠海马区神经干细胞增殖；DAPT组较颅脑损害组双标阳性的细胞数显着削减，提示DAPT或许按捺大鼠海馬区神经干细胞增殖。
临床报导高压氧能够下降中枢神经损害的伤残率和病死率[10-12]。刘海等[13]研讨以为高压氧使大鼠脊髓损害后内源性神经干细胞增殖、分解加强，脊髓损害后的神经功用得到改进，提示高压氧的医治效果或许与激活内源性神经干细胞的增殖有关。王晓莉等[14]研讨标明高压氧能够促进缺氧缺血性脑损害重生大鼠内源性神经干细胞的增殖，其机制与Wnt信号活化有关。而Notch信号通路同Wnt信号通路类似，也与神经发作密切相关。
Notch信号通路由Notch受体、Notch配体和CSLDNA结合蛋白3部分组成，配体与受体结合后，Notch受体相继发作两次蛋白水解。第2次是由γ-排泄酶在跨膜区接近胞膜内的位点切开蛋白，使具有核定位信号的胞质内区域（NICD）释放人细胞质，进入细胞核与DNA结合蛋白CSL相互效果，导致下流的Hes基因激活，参加神经系统的发作，故Hes 1的表达受Notch信号的调理。DAPT是一种特异性按捺γ-排泄酶活性的化学分子，被公以为Notch信号通路的有用阻断剂，能按捺Notch信号通路，笔者前期的试验中已证明DAPT经过按捺Notch信号通路的活性有抗脑胶质瘤效果[15]。将DAPT运用于神经干细胞的体外培育中，镜下可见神经干细胞数量显着削减，神经干细胞成长进程中所构成的神经球的直径也显着减小；相反的，过表达Notch 1、Hes 1和Hes 5能够促进神经前体细胞的增殖和自我更新[16-17]。本试验中运用DAPT干涉颅脑损害大鼠，DAPT组较颅脑损害组双标阳性的细胞数显着削减，提示DAPT按捺了大鼠海马区神经干细胞增殖，阐明Notch信号通路参加了内源性神经干细胞的增殖分解。
本试验中颅脑损害组、DAPT组、高压氧组双标阳性的细胞数在伤后7 d较伤后14 d显着增多，提示颅脑损害大鼠海马区内源性神经干细胞的增殖分解在伤后7 d到达顶峰。这与He等[18]的研讨成果相一致：大鼠脑缺血损害后6 h海马区神经干细胞开端表达nestin，伤后7 d后到达顶峰，持续时刻4周。本研讨成果对临床上高压氧医治机遇的启示：关于颅脑损害的患者高压氧医治应尽早进行，尽量在伤后7 d内开端高压氧医治。
综上所述，本研讨经过高压氧及Notch信号阻断剂对颅脑损害后大鼠进行干涉，证明高压氧能够经过Notch信号通路调理大鼠颅脑损害后内源性神经干细胞增殖分解，为往后进一步深入研讨Notch信号调控人神经再生机制供给理论基础，为将来临床医治供给新的靶点。
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（收稿日期：2017-07-25 本文修改：任 念）endprint