植物钩藤 一种钩藤属植物的rDNA ITS序列剖析
王业胜+李奇威+周林+管润锋+曾常青+朱爽
[摘要] 意图 以核糖体转录距离区（rDNA ITS）序列作为分子条形码，对一种常用中药材钩藤进行分子判定和遗传剖析，并阐明其在钩藤属内种间的分子体系发育联系。 办法 经过改进十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法对2015年7月收集的钩藤进行总DNA提取，运用通用引物对rDNA ITS序列进行PCR扩增，经克隆、测序后，运用MEGA软件进行体系发育剖析和构建体系发育树。 成果 测序得到该钩藤的rDNA ITS区序列长度为718 bp，序列剖析成果显现其与GenBank数据库中已有的钩藤（Uncaria rhynchophylla）rDNA ITS区序列之间类似度达99.8%，而且在体系发育树中并排聚类成一支。 定论 依据ITS区序列测定剖析的分子生物学办法和构建体系发育树的分子遗传学办法，能够对钩藤属药用植物进行分子判定和遗传剖析，为钩藤属药用植物的种间分类位置以及品种判定供给精确的分子依据。
[关键词] 钩藤；ITS序列；分子判定；体系发育树
[中图分类号] S567.239 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）03（a）-0004-04
[Abstract] Objective To clarify the phylogenetic relationship of one species of Uncaria，molecular identification and genetic analysis were carried out by using the rDNA ITS sequence as molecular barcoding. Methods Molecular identification and genetic analysis were carried out with the rDNA ITS sequence as molecular marker.Total DNA was extracted with modified CTAB method and thereby rDNA ITS regions were amplified with universal primer，sequenced and phylogenetic analysed with MEGA 6.0 at July 2015. Results The entire rDNA ITS sequence of Uncaria was 718 bp.Sequence analysis showed that the rDNA ITS sequence was closely related to Uncaria rhynchophylla available in GenBank and the similarity reached 99.8%. Conclusion Based on molecular biology methods of rDNA ITS region analysis，molecular identification is available in accurate classification on traditional Chinese medicinal material plants in Genus Uncaria and provide molecular evidence for taxonomy and identification of different species in Genus Uncaria.
[Key words] Uncaria；ITS sequence；Molecular identification；Phylogenetic tree
钩藤是茜草科钩藤属植物，首要散布于我国广东、广西、四川、云南、贵州等区域。《我国药典》2015年版规则的钩藤为茜草科植物钩藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]、大叶钩藤[Uncaria macrophylla Wall.]、毛钩藤[Uncaria hirsuta Havil.]、华钩藤[Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.]或无柄果钩藤[Uncaria sessilifructus Roxb.]的枯燥带钩茎枝[1]。
钩藤为常用中药，药用历史悠久，具有息风定惊、清热平肝的成效。可是钩藤药材在市场上的分类判定比较紊乱，影响了中药材用药的精确性和安全性。因而，有必要运用DNA分子符号技能进一步对钩藤属植物不同种间进行判定。核糖体转录距离区（rDNA ITS）序列作为分子条形码的判定才能现已在药用植物很多个科属基原植物及药材的判定中得到验证[2-12]。本研讨对采自广州中医药大学药王山的一种钩藤属药用植物进行分子判定和遗传剖析。现报导如下。
1 资料与办法
1.1 资料来历与判定
试验用的钩藤样品于2015年7月收集于广州中医药大学药王山。常绿木质藤本；小枝四棱柱形，褐色，季净无毛；叶腋有成对或单生的钩，向下曲折，先端尖；叶对生，具短柄，叶片卵形，卵状长圆形或椭圆形。本钩藤样品经广东药学院曾常青教授开端从形状上判定为钩藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]。钩藤总DNA的提取选用新鲜收集的叶片，或许运用密封袋中现已用硅胶快速枯燥过的新鲜收集的叶片。
1.2 仪器和试剂
BIO-RAD T100TM Thermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司），Thermo Scientific Heraeus Pico17台式离心机（美国赛默飞世尔科技公司），HHS-2S电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂），TP - 402电子剖析天平（美国丹佛仪器北京有限公司），SW-CJ-1F清洁工作台（姑苏安泰公司），BG-Sub MIDI水平电泳仪（北京永久生物器件公司），天能-4100数码凝胶图画剖析体系（上海天能公司），SPX智能型生化培养箱（广州深华公司）。
SYBR Green Ⅰ电泳染料购自北京百泰克生物技能有限公司，DL2000 DNA Marker购自TIANGEN生化科技（北京）有限公司，pMD18-T Vector、Taq酶以及DNA凝胶收回试剂盒均购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司，通用引物组成由生工生物工程（上海）股份有限公司完结，十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自北京鼎国兴盛生物技能有限责任公司。其他试剂均为剖析纯。
1.3 办法
1.3.1 钩藤植物基因组DNA的提取 钩藤植物基因组DNA的提取选用改进的CTAB法[13]：称量约1 g新鲜收集的叶片在液氮的低温条件下研磨成细粉末。将粉末转移到50 ml的离心管中，参加约5 ml 65℃预热的CTAB裂解液（4%CTAB，1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-Cl，25 mmol/L EDTA，2%β-巯基乙醇，1%PVP，pH 8.0），65℃水浴2 h（每隔30 min轻摇振动1次）。每1毫升混合液分装到1.5 ml Eppendorf管中，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用等体积的Tris饱满酚（pH 8.0），酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）和氯仿-异戊醇（24∶1）各抽提1次，12 000 r/min离心10 min，取上清液，参加0.1倍体积3 mol/L NaAc（pH 5.2）溶液，再参加2倍体积无水乙醇，-20℃沉积1 h，12 000 r/min离心10 min，移去上清液，用1 ml 70%冷乙醇洗刷2次，枯燥后用50 μl无菌1×三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-ethylene diamine tetraacetic acid，TE）缓冲液回溶。取2 μl回溶后的总DNA溶液进行电泳判定，记载凝胶成像成果。
1.3.2钩藤植物ITS序列的PCR扩增以及扩增产品的纯化 运用扩增ITS序列全长的引物组[14-15]ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAA-GTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）扩增药王山的钩藤植物总DNA的ITS序列。制造20 μl 的PCR体系：10×PCR Buffer（2.5 mmol/L，Mg2+ Plus）2 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μl，引物量为8 pmol，Taq（5 U/μl）0.1 μl，参加模板DNA约50 ng，剩余体积以无菌超纯水补足。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共循环30次，最终在72℃延伸10 min。PCR产品用1%的琼脂糖凝胶电泳判定，在凝胶成像体系下检测并记载成果。PCR扩增产品依照大连宝生物公司的DNA凝胶收回试剂盒的具体操作进行割胶收回和纯化。
1.3.3 ITS区片段的衔接、转化以及测序 运用DNA凝胶收回试剂盒纯化后的PCR扩增产品与pMD18-T-Vecter衔接，构成意图片段与载体构成的环形质粒并选用热激法转化到Escherichia coli JM109感受态细胞，在选择性培养基上进行氨苄西林的挑选。从平板上选取3个阳性重组单克隆菌落，进行过夜摇菌后各取1 ml菌液由华大公司进行ITS区序列测定，每个样品均进行正反双向测序。
1.3.4 ITS序列比对剖析以及体系发育树的构建 将测序得到的峰图选用Bioedit软件检查和校正，去除低质量序列后在NCBI上选用Blast进行比对剖析，得到世界基因数据上与其同源的序列片段以及序列类似性程度。依据类似性程度开端断定药王山钩藤样品的基源。将得到的序列运用MEGA软件（Version 6.06）进行分子体系发育剖析。经过最大精约法（maximum parsimony，MP）进行核算剖析，树立药王山钩藤植物的最大精约树。用自展查验法（Boot-strap text）1000次查验MP上各分支的置信水平。
2 成果
2.1 钩藤总DNA的提取成果
药王山的钩藤样品总DNA经琼脂糖电泳后扫描摄影并记载成果，可见总DNA电泳图谱出现一条明晰完好的主条带，没有显着降解（图1），阐明改进的CTAB法能够有用提取药王山钩藤样品的基因组DNA。
2.2 药王山钩藤样品的ITS序列PCR扩增成果
以提取的药王山钩藤样品的总DNA为模板，从模板原液开端别离稀释5个梯度浓度进行ITS区序列的PCR扩增。从PCR的扩增成果来看，模板DNA在1×102～1×103的稀释倍数时，PCR的扩增效果是最理想的。在模板浓度最佳的情况下，药王山钩藤样品的ITS区序列的PCR扩增产品的电泳图谱出现明晰完好的条带，而且条带较亮，没有非特异扩增条带，巨细在720 bp左右（图2），阐明在最佳的模板浓度条件下能够有用扩增ITS区序列，钩藤基因组DNA中的按捺物对PCR的影响到达最小。
2.3 ITS序列剖析
选用Bioedit软件检查和校正，可知测序得到的核糖体ITS区序列的长度为718 bp。为了获得与该序列亲缘联系附近的钩藤属其他种的序列，把测序得到的ITS序列与GenBank数据库中已有的ITS序列进行比较剖析。使用Bioedit软件对DNA序列之间进行比较剖析发现，该钩藤样品与GenBank数据库中已有的钩藤（Uncaria rhynchophylla，KF881265）的类似度最高，到达99.8%，故将该钩藤植物归类为钩藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]。
2.4 分子体系发育剖析
选用MEGA软件将测序得到的ITS序列与其亲缘联系附近的钩藤属的其他种的ITS序列进行序列比对后用MP核算和剖析，并以Nauclea xanthoxylon（AJ346877）为外类群构建一棵药王山钩藤植物的体系发育树（图3），评价各物种之间的亲缘性。经过对14个物种ITS序列的精约性剖析发现，发育树的枝长为107，一致性指数为0.739 130，保存指数为0.796 610，一切位点复合指数和精约性信息位点别离为0.707 271与0.588 799。
3 评论
有文献标明，生物碱是钩藤的首要化学成分[16]，而生物碱首要是以钩藤碱和异钩藤碱为主。钩藤生物碱的首要成效是抗血栓构成、抗惊厥效果、抗血小板集合以及降血压等[17]，可是关于钩藤的药效成分，钩藤属内不同种的钩藤中药材仍是有显着的不同[18]。再者市场上出售的钩藤中药材品种比较紊乱，仅靠形状学等传统的剖析办法难以辨别，经常出现以次充好的现象，严重影响了中药材用药的精确性和安全性。因而，有必要运用一种快速的、高活络的办法进一步判定钩藤属植物的种间联系。跟着分子生物学的快速开展，使用DNA分子符号技能对药用植物进行判定已逐步成为研讨的热门[19-20]。而ITS序列作为DNA条形码的剖析技能具有技能简略、成果精确、重复性好等长处，广泛使用于药用植物的判定。依托ITS序列符号能够作为钩藤中药材种内和种间辨别的有用分子标志，运用该办法的原理，对钩藤属中药材进行分子判定和遗传剖析，有利于拨乱反正。
ITS序列的剖析办法很好地弥补了中药材判定的传统剖析办法（依据形状学、组织学和化学成分等）的缺乏，能够从分子遗传视点对钩藤等药用植物的种间分类位置以及品种判定供给分子生物学依据，然后添加中药材用药的精确性和安全性。本研讨对收集自广州中医药大学药王山的一种钩藤植物进行基因组DNA提取，ITS区序列扩增，序列测定与剖析，以及选用MP构建该钩藤样品在其近缘种之间的体系发育树，从树图能够看出，该钩藤样品与GenBank数据库中已有的钩藤（U.rhynchophylla，KF881265）聚类成为一枝，支撑率到达84%；然后又与钩藤属其他种的常用钩藤植物，别离是华钩藤（U.sinensis，FJ980386）、毛钩藤（U.hirsute，GU937110）、北越钩藤（U.homomalla，KF881255）、白钩藤（U.sessilifructus，GU937111）以及攀茎钩藤（U.scandens，KF881275）聚类成一枝。由此可见，从分子生物学和遗传学的视点剖析，该钩藤样品与GenBank数据库中钩藤（U.rhynchophylla，KF881265）的亲缘联系最近，而且与之序列的类似度高达99.8%，而与GenBank数据库中已有其他种常用钩藤植物的亲缘联系较远，并不直接与这些种的钩藤植物聚类成为一枝，所以从分子体系发育水平上支撑了依据形状特征把该钩藤属中药材植物判定为钩藤[Uncaria rhynchophylla （Miq.）Miq.ex Havil.]的开端成果，标明依据rDNA ITS序列剖析和构建体系发育树的分子生物学办法能够快速精确地对钩藤等药物植物进行分子判定和遗传剖析。
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（收稿日期：2015-12-16 本文修改：卫 轲）