药材指纹图谱研讨 香附药材HPLC指纹图谱研讨

蒋莉娟+++皮胜玲++方铁铮+++姚江雄++++许招懂++++林丽美

[摘要] 意图 树立香附药材HPLC指纹图谱，结合化学计量手法，对多批次药材进行质量操控。 办法 以Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以甲醇（A）-水（B）为活动相，梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm；柱温25℃，对10批药材样品进行类似度剖析、聚类剖析和主成分剖析。 成果 树立了香附药材专特色的HPLC指纹图谱，标明了16个共有指纹峰，10批样品分为3大类。 定论 将HPLC指纹图谱与化学计量手法相结合，可有用对香附药材进行真伪辨别和质量点评，为进步其全体质量操控供给参阅。

[关键词] 香附；高效液相色谱法；指纹图谱；类似度点评；聚类剖析；主成分剖析

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）01（a）-0004-04

S 香附为莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的枯燥根茎，具有疏肝解郁、理气宽中、调经止痛的成效，用于医治肝郁气滞所造成的的胸胁肿痛、疝气痛苦、乳房肿痛、脾胃气滞、脘腹痞闷、胀满痛苦、月经不调、经闭痛经之症，为妇科常用药[1]。《本草纲目》称之为“气病之总司，女科之主帅”，主产于山东、浙江、湖南、河南等地，以山东为道地药材。香附首要含蒸发油类成分，此外还有萜类、黄酮类、酚类、生物碱等化合物[2]。现代药理研讨显现，香附具有抗炎、抗血小板、降血糖、维护神经系统、抗过敏等效果[3]。指纹图谱是根据对中药物质群全体效果的知道，借助于波谱和色谱等技能取得中药化学成分的光谱或色谱图，是完成辨别中药真实性、点评质量共同性和产品安稳性的可行形式，具有信息量大、特征性强、全体性和含糊性等特色[4]。本研讨选用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）对10批香附药材进行研讨并树立指纹图谱，旨在为香附药材的质量操控供给科学依据。

1 仪器与资料

1.1 仪器

KQ-100B型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；T-214型电子剖析天平（Denver公司）；Waters e2695高效液相色谱系统，Empower工作站，含四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器（Waters公司）。

1.2 资料

甲醇（Honeywell公司，色谱纯）；水为超纯水（试验室制备）。α-香附酮对照品（批号：110748200507）购自我国药品生物制品检定所，供含量测定用。10份不同批次或产地的香附药材样品均由广州星群（药业）股份有限公司供给，经湖南中医药大学药学院药用植物教研室王智教师判定为莎草科植物莎草的枯燥根茎，详细信息见表1。

表1 香附药材样品来历

2 办法与成果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；活动相：甲醇（A）-水（B）为活动相系统梯度洗脱（0～45 min，40%→80%A；45～60 min，80%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样体积：10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精细称取α-香附酮对照品适量，加甲醇溶解定容至10 ml，得到浓度为0.0261 mg/ml的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取香附药材粉末（过60目筛）约1 g，精细称定，置100 ml具塞锥形瓶中，精细参加甲醇10 ml，密塞，称重，超声处理（功率160 W，频率59 kHz）30 min，放冷，再称定分量，用甲醇补足减失的分量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 办法学调查

2.4.1 精细度试验 取同一批（XG140501）药材粉末，按“2.3”项下办法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，接连进样6次，测定指纹图谱。以7号峰的保存时刻和峰面积为参照，核算样品中所含16个共有峰的相对保存时刻和相对峰面积。各共有峰相对保存时刻的RSD为0.003%～0.130%，相对峰面积的RSD为0.15%～2.10%，提示仪器的精细度杰出。

2.4.2 重复性试验 取同一批（20111201）药材粉末，按“2.3”项下办法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，别离进样6次，测定指纹图谱。调查样品中所含16个共有峰的相对保存时刻和相对峰面积，各共有峰相对保存时刻的RSD为0.01%～0.48%，相对峰面积的RSD为0.01%～2.77%，提示办法的重复性杰出。

2.4.3 安稳性试验 取1份（20111201）药材粉末，按“2.3”项下办法制备供试品溶液，别离于0、4、8、12、15、24 h测定指纹图谱，调查样品中所含16个共有峰的相对保存时刻和相对峰面积，各共有峰相对保存时刻的RSD为0.10%～0.63%，相对峰面积的RSD为0.33%～2.74%，提示香附药材样品溶液在24 h内安稳性杰出。

2.5 指纹图谱的树立

2.5.1 指纹图谱共有形式的树立 取10批药材粉末，按“2.3”项下办法制备供试品溶液，别离进样10 μl，记载HPLC色谱图（图1）。选用国家药典委员会中药色谱指纹图谱类似度点评系统（2.0版）进行剖析，生成共有形式指纹图谱（图2），其间以峰7为参照物，其他各共有峰与峰7的相对保存时刻与相对峰面积见表2、表3。

2.5.2 共有峰的断定 10批香附生成的对照指纹图谱标定了16个共有峰，详细见图2。对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认15号峰为α-香附酮。

2.5.3 指纹图谱的类似度点评 上述10批香附药材类似度核算成果依次为0.999、0.988、0.966、0.996、0.981、 0.771、0.997、0.913、0.996、0.975，除批次为20111201的香附药材类似度为0.771外，其他批次类似度均>0.9，提示香附药材样品具有杰出类似性。

2.6 聚类剖析

将10批香附药材HPLC指纹图谱中16个色谱峰的峰面积与样品号树立矩阵，导入SPSS软件，选用组间联接法，以欧氏间隔的平方为测度，对数据进行标准化转化，得到香附药材的聚类剖析图（图4）。成果显现，10批样品可分为三大类，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9聚为一类，S5、S10别离独自聚为一类。聚类成果显现，药材各批次间成分全体差异较小。

2.7 主成分剖析

选用SPSS软件对10批香附药材样品进行主成分剖析，详细见图5。成果显现，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9会集散布在一个区域，各样品彼此之间间隔较近；S5、S10与其他样品相距较远，样品可分为3大类。该图直接反映了各批次样品之间的差异巨细，与聚类剖析成果共同。

3 评论

3.1 色谱条件的优化

本试验比较了245、254、265、300和320 nm波长下的色谱图[5-9]，成果在254 nm检测条件下出峰较多，各峰吸收均匀，峰形较好，故挑选254 nm作为检测波长。本试验调查了乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸水不同活动相系统[10-14]，成果显现甲醇-水能对样品中各成分完成较好的别离，因而活动相组成挑选甲醇-水；还调查了25、30、35℃柱温条件下各色谱峰的别离状况，成果显现，不同柱温下色谱峰略有差异，当温度升高时，部分峰发作相对位移与兼并，使别离度下降，因而挑选柱温25℃；此外，本试验比较了Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）、LiChrospher■100 RP-18 endcapped（5 μm）Hibar■RT 250-4.6、Athena C18120A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4种不同类型的色谱柱，成果显现，Kromasil柱各色谱峰的别离度、峰形较其他色谱柱好，因而本试验挑选Kromasil色谱柱。

3.2 提取办法的调查

本试验别离对提取溶剂（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）、提取办法（超声、加热回流）、提取时刻（15、30、45、60 min）及提取体积（10、20、25、30 ml）进行了调查[15-18]，根据出峰数目和峰面积终究选用甲醇超声提取30 min，提取体积10 ml，该办法提取较为彻底，提取功率最高。

3.3 类似度成果剖析

10批不同批次或产地的香附药材HPLC指纹图谱类似度较高，除批次20111201的香附药材类似度为0.771外，其他批次的类似度均>0.9，提示药材首要成分构成根本共同，药材质量安稳。主成分剖析与聚类剖析的成果彼此佐证，成果共同，药材样品可聚为三类，S3和S10与其他样品相距较远，提示三类药材质量存在必定差异。

3.4 试验成果剖析

不同批次或产地的香附药材HPLC指纹图谱既有共性又存在差异，首要色谱峰的全体相貌根本共同，但各峰峰面积有所不同，这说明环境要素会对药材质量发生必定影响，是否与成长环境、土壤条件等要素有关有待进一步调查[19-21]。本试验使用指纹图谱和聚类剖析、主成分剖析相结合的办法进行研讨，可以更全面、精确地判别药材的真伪与好坏，可有用用于香附药材的质量操控与判定。

[参阅文献]

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（收稿日期：2015-08-12 本文修改：祁海文）