水晶兰苷 巴戟天不同炮制品中水晶兰苷的大鼠体内血药浓度及安排散布研讨
史辑 景海漪 黄玉秋 范亚楠 贾天柱
摘要：意图 探討编造对巴戟天中水晶兰苷在大鼠体内血药浓度及安排散布的影响。办法 别离给予SD大鼠灌胃巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天的正丁醇萃取物，选用HPLC，Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），以甲醇-0.4%磷酸溶液为活动相，梯度洗脱，柱温25 ℃，检测波长235 nm，测定血浆及各安排中水晶兰苷的含量。成果 巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天中水晶兰苷高、中、低剂量（0.177、1.77、17.7 ?g/mL）的药代动力学特征契合二室模型，在所研讨的剂量范围内，AUC与给药剂量呈现杰出的线性相关性，契合线性动力学特征。灌胃给药60 min后，水晶兰苷在肾、肺、肝、脾的浓度到达最大，在肾安排和肝安排中的浓度散布为盐巴戟天>巴戟肉>制巴戟天，在脾安排中浓度散布为制巴戟天>盐巴戟天>巴戟肉。定论 不同编造办法对巴戟天在大鼠体内血药浓度及安排散布有必定影响。
关键词：巴戟天；水晶兰苷；药代动力学；安排散布；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）05-0076-06
Effects of Monotropein in Different Processing Products of Morindae Officinalis Radix on Plasma Concentration and Tissue Distribution in Rats SHI Ji1，2，3， JING Hai-yi1， HUANG Yu-qiu1， FAN Ya-nan1， JIA Tian-zhu1，2，3 （1. College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 2. Key Laboratory of Processing Principle Analysis， State Administration of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 3. Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for TCM， Dalian 116600， China）
Abstract： Objective To study the effects of monotropein in different processed products of Morindae Officinalis Radix on plasma concentration and tissue distribution in rats. Methods The n-butanol extracts of Morindae Officinalis Radix and its processing products by salt and licorice were given to SD rats orally. HPLC was employed， Venusil MP C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m） with the mobile phase consisting of methanol-0.4% phosphoric acid at the detection wavelength of 235 nm and a column temperature of 25 ℃. The content of monotropein in plasma and tissues was determined. Results The pharmacokinetics of the monotropein in three different dosages （0.177， 1.77， 17.7 ?g/mL） of different processing products of Morindae Officinalis Radix in the rats fit the two-compartment model. In the dose range studied， AUC showed a good linear correlation with dose， which accorded with linear dynamic characteristics. After 60 min of gavage， the concentration of monotropein reached the highest in kidney， lung， liver and spleen. The concentrations of monotropein were Morindae Officinalis Radix processed by salt > Morindae Officinalis Radix > Morindae Officinalis Radix processed by licorice in kidney tissues and liver tissues， Morindae Officinalis Radix processed by licorice > Morindae Officinalis Radix processed by salt > Morindae Officinalis Radix in spleen tissues. Conclusion The different processing methods have certain influence on the plasma concentration and tissue distribution of Morindae Officinalis Radix in rats.
Key words： Morindae Officinalis Radix； monotropein； pharmacokinetics； tissue distribution； HPLC
巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的枯燥根，具有补肾阳、抗风湿、强筋骨效果。2015年版《中华人民共和国药典》收载其编造种类有巴戟天、巴戟肉、盐巴戟天、制巴戟天，巴戟天生品偏于祛风湿，盐巴戟天补肾壮阳效果增强，制巴戟天则偏于脾肾双补[1]。环烯醚萜苷类是巴戟天的首要有效成分，其间以水晶兰苷（monotropein）含量最高。本课题组前期研讨发现，巴戟天经编造后水晶兰苷含量显着添加[2]。近年来对巴戟天编造前后的药理药效学研讨逐步增多[3-6]，但编造影响巴戟天有效成分在体内散布的研讨没有见报导。药物的体内代谢进程在必定程度上对药效有影响。本研讨比较巴戟天不同编造品中水晶兰苷在大鼠体内的血药浓度及其安排散布特征，为体系阐明巴戟天编造前后成效改变奠定根底。
1 仪器、试药与动物
Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），紫外检测器（美国安捷伦公司），Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m，天津博纳艾杰尔科技有限公司），Mettler AE240电子剖析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HGC-12A氮吹仪（天津恒奥科技有限公司），XW-80A微型涡旋混合仪（上海青浦沪西剖析仪器厂），TGL-16G台式离心机（上海安亭科学仪器厂），微量移液枪（芬兰雷勃仪器厂）。
巴戟天药材购自广东省德庆高粱镇巴戟天GAP栽培基地，甘草药材购自大连开发区阳光大药房，经辽宁中医药大学中药断定教研室翟延君教授断定，别离为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的枯燥根和豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的枯燥根及根茎；精制盐（大连盐业有限公司，批号20110102）。水晶兰苷对照品（批号MUST-11062204，质量分数≥98.0%），成都曼思特生物科技有限公司；栀子苷对照品（批号110749200511，质量分数≥98.0%），我国食品药品检定研讨院；乙腈和甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为剖析纯。
SPF级SD雄性大鼠100只，40日龄左右，体质量（200±20）g，大连医科大学试验动物中心，动物合格证号SCXK（辽）2008-0002。在温度20～22 ℃、相对湿度45%～65%、光照/漆黑12 h/12 h条件下养殖，自在饮食、饮水，适应性养殖1周。
2 办法与成果
2.1 色谱条件
色谱柱为Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），活动相为甲醇-0.4%磷酸溶液，梯度洗脱（见表1），流速为1.0 mL/min，检测波长为235 nm，柱温为25 ℃。进样量为20 ?L。内标为栀子苷。
2.2 溶液制备
2.2.1 编造品制备 ①巴戟肉：取原药材，除掉杂质及木心，洗净，晾干。②盐巴戟天：取净巴戟天，参加适量食盐水（每100 g巴戟天，盐2 g），拌匀，闷润，待盐水被吸尽后蒸透，趁热除掉木心，切段枯燥。③制巴戟天：取甘草煎汤3次，去渣，得甘草汁。取净巴戟天，加药材量1.5倍甘草汁（相当于每100 g巴戟天加甘草6 g），文火煮至甘草汁被吸尽，趁热抽去木心，切段，枯燥。
2.2.2 供试品溶液制备 别离取巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天，切成2～5 mm的段，参加8倍量80%乙醇，回流提取3次，每次2 h，过滤，弃去药渣，滤液减压浓缩至无醇味，得浓缩液。浓缩液加适量蒸馏水混悬，顺次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，收回溶剂。搜集正丁醇萃取物，加适量蒸馏水混悬至浓度为4 g/mL的提取液。
2.2.3 对照品溶液制备 精细称取水晶兰苷对照品适量，加甲醇制成0.354 0 mg/mL对照品溶液。再别离以适量甲醇按倍数稀释法稀释得水晶兰苷系列对照品溶液，置4 ℃冰箱中保存备用。
2.3 内标溶液制造
精细称取栀子苷对照品适量，加甲醇制成0.423 0 mg/mL对照品溶液，置4 ℃冰箱中保存备用。
2.4 给药与样品收集
取健康SD大鼠，随机分为巴戟肉组、盐巴戟天组和制巴戟天组，给药前禁食不由水24 h，各组大鼠别离灌胃给予相应提取物20 g/kg 1次。于给药前和给药后5、10、15、20、30、45、60、120、240、360、480、720、1440 min经眼眶静脉丛取血约0.5 mL，置预先肝素化的离心试管中，10 000 r/min离心10 min，别离血浆，-20 ℃冰箱保存备用。
取健康SD大鼠，给药前禁食不由水24 h，巴戟肉组、盐巴戟天组和制巴戟天组大鼠别离灌胃给予相应药物20 g/kg 1次。别离于给药后15、60、360 min后处死大鼠，每个时刻点6只，当即解剖收集心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠和脑安排，安排样品经生理盐水冲刷，去在外表的血液和内容物后，称重，装入自封袋中，-20 ℃冰箱冰冻保存备用。
2.5 血浆及安排样品预处理
取血浆样品200 ?L，置2.0 mL肝素化离心管中，精细参加内标溶液（栀子苷）100 ?L、乙腈200 ?L、甲醇400 ?L，涡旋震动混合2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，35 ℃空气流吹干，残留物用甲醇- 0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测。
取安排样品（心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠和脑）各0.5 g，精细稱定，参加生理盐水1 mL，用匀浆机制备安排匀浆。安排匀浆超声后，10 000 r/min离心5 min。取上层液100 ?L，置2.0 mL离心管中，精细参加内标溶液（栀子苷）100 ?L、乙腈200 ?L、甲醇400 ?L，涡旋震动混合2 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液，35 ℃空气流吹干，残留物用甲醇- 0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测。
2.6 办法学调查
2.6.1 专特点 空白血浆、加药血浆和血浆样品HPLC图显现，血浆内源性物质对药物和内标的检测无搅扰，水晶兰苷和栀子苷内标峰峰形好、别离度高，标明该法的专特点好。取大鼠空白安排（小肠）匀浆上清液100 ?L，安排样品中除不加内标溶液外，其他按“2.5”项下安排样品处理操作，取得空白样品色谱图；将水晶兰苷对照品溶液和栀子苷内标溶液参加空白安排（小肠）匀浆中，同法操作，取得相应色谱图；同法操作，取得大鼠灌胃巴戟天提取液后小肠安排样品色谱图。成果标明，安排中内源性物质不搅扰水晶兰苷和内标物栀子苷的测定。色谱图见图1。
2.6.2 规范曲线 取大鼠空白血浆100 ?L，顺次参加系列对照品溶液100 ?L，制造成相当于大鼠血浆药物浓度别离为17.7、7.08、3.54、1.77、0.708、0.354、0.177 ?g/mL的血浆样品。按“2.5”项下办法处理并测定，树立规范曲线。以血浆中水晶兰苷浓度（?g/mL）为横坐标，水晶兰苷与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（1/CC）最小二乘法进行回归核算，得回归方程Y=3.509 8X-0.096 8（r=0.996 8），标明血浆中水晶兰苷在0.177～17.7 ?g/mL浓度范围内线性关系杰出。
取大鼠空白安排（小肠）匀浆上层液100 μL，顺次参加系列对照品溶液10 μL，制造成相当于大鼠安排药物浓度为17.7、7.08、3.54、1.77、0.708、0.354、0.177 μg/mL的安排样品。按“2.5”安排样品处理项下操作，进样20 μL测定，树立规范曲线。以安排中水晶兰苷浓度（?g/mL）为横坐标，水晶兰苷与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（1/CC）最小二乘法进行回归核算，得回归方程Y=0.553 6X-0.051 4（r=0.994 0），成果标明，安排中水晶兰苷在0.177～17.7 ?g/mL浓度范围内线性关系杰出。
2.6.3 精细度 按“2.5”项下办法别离制造水晶兰苷低、中、高3个浓度的大鼠空白血浆/安排样品（0.177、1.77、17.7 ?g/mL），每一浓度进样6次，接连测定3 d，随行规范曲线。依据当日规范曲线核算各样品的浓度，与制造浓度对照，求得血浆/安排样品测定办法的日内精细度和日间精细度。测定成果显现，低、中、高浓度日内精细度RSD=5.8%，日间精细度RSD=6.3%，契合测定要求。
2.6.4 安稳性 取大鼠空白血浆（安排）100 ?L，按“2.5”项下办法制造水晶兰苷低、中、高3个浓度的空白血浆/安排样品（0.177、1.77、17.7 ?g/mL），室温保存24 h，再次测定，以调查样品在室温条件下的安稳性。每一浓度进行3样本剖析。将2次测得成果的均值进行对照，核算相对误差（RE）。低、中、高3个浓度的RE值别离为4.7%（3.8%）、3.9%（4.3%）、4.2%（4.1%），标明水晶兰苷血浆/安排样品处理后在室温至少可安稳寄存24 h。
2.6.5 冻融安稳性 同法制造低、中、高3个浓度的血浆/安排样品，经重复3次-20 ℃冷冻-室温溶解，再测定样品浓度，以调查样品在冷冻和冻融条件下的安稳性。每一浓度进行3样本剖析。将冻融前后2次测得成果的均值进行对照，核算相对误差（RE）。低、中、高3个浓度的RE值别离为3.9%（4.5%）、4.1%（4.0%）、4.5%（3.9%），标明血浆样品冻融3次根本安稳。
2.6.6 提取收回率 取大鼠空白血浆100 ?L，按“2.5”项下办法制备低、中、高3个浓度的样品（别离为0.177、1.77、17.7 ?g/mL），每个浓度进行6样本剖析。另取空白血浆（安排）100 ?L，按“2.5”项下办法操作，取上清液，别离参加相应浓度的对照品溶液100 ?L（各浓度平行操作3个样品），于35 ℃空气流下吹干，残留物用甲醇-0.4%磷酸溶液（5∶95）100 ?L超声溶解，12 000 r/min离心5 min，取上清液20 ?L进样检测，取得相应峰面积值（3次测定的均匀值）。
以每一浓度2种处理办法得峰面积比值，核算提取收回率，成果本法在大鼠血浆（安排）样品低、中、高3个浓度的提取收回率别离为75.0%±4.1%（80.9%±3.2%）、74.8%±3.5%（90.1%±3.7%）、75.1%±2.8%（87.3%±2.9%）。
同法调查内标收回率为86.8%±4.5%（88.3%±3.5%）。
2.7 水晶兰苷药时曲线
不知道样品测定按“2.5”项下办法操作，记载峰面积，核算血药浓度，并制作均匀血药浓度-时刻曲线图，成果见图2。
2.8 药代动力学参数测定
选用DAS2.1.1软件对各组大鼠灌胃巴戟天不同编造品后安排中水晶兰苷浓度数据进行剖析，自选房室数和权重，别离进行一室、二室模型及1、1/C、1/CC 3种权重的曲线拟合，依据AIC最小和R2最大的准则，断定巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天均归于二室模型，权重系数为1/CC。成果见表2。
2.9 水晶兰苷在大鼠体内的安排散布
大鼠别离灌胃给予巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天提取液后，水晶兰苷在大鼠体内不一起刻点（15、60、360 min）各安排中的浓度见表3。
选用SPSS19.0计算软件剖析各组大鼠灌胃巴戟天不同编造品后水晶兰苷在不一起刻点的安排散布数据，成果见图3～图5。
3 评论
本试验调查了Cromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）和Venusil MP C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，成果标明，Venusil MP C18色谱柱可使水晶兰苷得到较好保存。试验中对乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液作为活动相按不同份额进行了调查，一起调查了等度洗脱和梯度洗脱的别离效果，发现甲醇-0.4%磷酸溶液梯度洗脱（0～12 min，5%A～28.8%A；12～18 min，28.8%A～60%A；18～20 min，60%A～75%A；20～25 min，75%A～80%A）時，血浆样品中水晶兰苷到达基线别离，出峰时刻适中，血浆中的内源性物质无搅扰。水晶兰苷的最大吸收波长为235 nm，栀子苷的最大吸收波长为238 nm，考虑到全体效果，挑选235 nm作为收集波长。一起，依据被测组分水晶兰苷的理化性质和色谱行为，挑选栀子苷作为内标，经重复调整活动相后无搅扰。
本研讨选用DAS2.1.1软件进行房室模型拟合剖析，成果显现，巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天三者均契合二房室模型，即大鼠灌胃后，水晶兰苷瞬间就可在血液供给丰厚的安排（如血液、肝、肾等）散布到达动态平衡，然后在血液供给较少或血流缓慢的安排（如脂肪、皮肤、骨骼等）散布到达动态平衡。巴戟肉、盐巴戟天和制巴戟天中水晶兰苷的体内散布进程没有显着差异。
与巴戟肉比较，大鼠灌胃制巴戟天和盐巴戟天后达峰时刻显着加速，半衰期缩短，阐明其消除敏捷；盐巴戟天AUC添加，标明其生物利费用较高。辅料盐和甘草汁能促进水晶兰苷的吸收。
安排散布试验标明，在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠安排中都能检测到水晶兰苷的存在，标明水晶兰苷能够在大鼠体内广泛散布与代谢，特别是在肾安排中的浓度较高。
口服给药15 min后，水晶兰苷可散布至多数安排（脑安排在外），胃中含量最高，小肠次之，这可能与口服给药办法有关；大部分血流较丰厚的安排（肾、肺、肝和脾）在给药60 min后药物浓度达顶峰，然后逐步下降，至6 h时已不能检测到原型药，这与该药在血液中的消除进程根本同步，标明水晶兰苷的安排散布与血流灌注进程密切相关。
巴戟肉组肝、肺、肾随大鼠代谢时刻改变水晶兰苷含量显着添加；盐巴戟天组各安排随大鼠代谢时刻改变水晶兰苷含量均有添加，心、肝、肺和肾中水晶兰苷含量在60 min呈现最大值；制巴戟天组胃、大肠和小肠随大鼠代谢时刻改变水晶兰苷含量显着下降，而心、肝、脾、肺、肾含量添加，且脾中水晶兰苷的含量在60 min呈现最大值。
本研讨成果标明，巴戟天经盐制后，能改进水晶兰苷在体内散布、吸收、代谢，促进其在肾安排的吸收，这与“盐制入肾经”的传统理论相符。巴戟天经甘草水制后，延长了水晶兰苷在大鼠体内被吸收的时刻，且促进了水晶兰苷在脾和胃的吸收，这也从安排散布视点阐明晰制巴戟天脾肾双补效果增强的原因。
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