髓样癌术后一个月的目标 多目标正交实验优化理冲生髓饮的醇提工艺

王艳宏 赵娟萍 尚冬雪 赵雪 田苗 韩凤娟

摘要：意图 优选理冲生髓饮的最佳醇提工艺。办法 选用L9（34）正交试验法，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷的搬运率和干膏得率为目标，经过归纳评分法，调查乙醇浓度、提取时刻、提取温度、溶媒用量对理冲生髓饮醇提工艺的影响。成果 最佳提取工艺为：10倍量60%乙醇浸泡2 h后，加热回流提取2次，提取时刻1.5 h，提取温度80 ℃。定论 该工艺提取率高，工艺安稳、可行，可为理冲生髓饮的进一步研讨供给数据。

关键词：理冲生髓饮；正交试验；多目标；醇提工艺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.018

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0076-05

Abstract： Objective To optimize the ethanol extraction technology of Lichong Shengsui Decoction. Methods An L9（34） orthogonal test was used in the study. The extraction rates of calycosin glycoside， icariin， baohuoside Ⅰ， ginsenoside Rg1， ginsenoside Re， ginsenoside Rb1， astragaloside， and ginsenoside Rd were set as indexes. The influence of ethanol concentration， extraction time， extraction temperature， and amount of ethanol on the yield of Lichong Shengsui Decoction were detected by comprehensive scoring method. Results The optimal ethanol extraction technology for Lichong Shengsui Decoction was soaking for 2 h with ten times of 60% ethanol and then reflux extracting for two times； extraction time was 1.5 h each time at 80 ℃. Conclusion The optimal extraction technology is efficient， stable and feasible， which can provides data for the further study of Lichong Shengsui Decoction.

Key words： Lichong Shengsui Decoction； orthogonal test； multi-index； ethanol extraction technology

理冲生髓饮是国家级老中医、黑龙江省名中医王秀霞教授有理冲丸的根底上结合多年临床实践总结出的有用防治卵巢肿瘤的中药复方制剂。现代研讨标明其可进步卵巢癌患者的免疫功用[1]，对人卵巢癌细胞SKOV3的体外成长有按捺效果，可阻断Bcl-2癌基因蛋白表达[2-3]，对化学致癌因子诱发的大鼠卵巢肿瘤有按捺和阻断效果[4]，对P53基因蛋白、血管内皮成长因子基因蛋白、Casp-8和CXCL2基因的过度表达有调节效果[5-7]。理冲生髓饮具有破血消癥、软坚散结、补气养血、填精益髓之功。方中所含有用成分品种很多，包含蒸腾油类、皂苷类、黄酮类、多糖

类等。其间，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人參皂苷Rb1、人参皂苷Rd和黄芪甲苷等成分具有抗肿瘤、进步免疫功用等活性[8-14]。本研讨选用正交试验法，调查乙醇浓度、提取时刻、提取温度、溶媒用量对上述成分搬运率和干膏得率等多目标的影响，优选理冲生髓饮的醇提工艺，以期为理冲生髓饮的进一步深入研讨供给数据。

1 仪器与试药

SFE220-40-100超临界萃取设备（江苏温奥机械设备有限公司），AK-400B中药粉碎机（泰州金诚制药机械有限公司），DZF-6050真空枯燥箱（北京北方利辉试验仪器设备有限公司），KDM-1000调温电热套（江苏杰瑞尔电器有限公司），TGL-16G高速离心机（北京佳源兴业科技有限公司），FA2104A电子剖析天平（上海精天电子仪器有限公司），LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），BenchTop K真空冷冻枯燥机（美国VIRTIS公司），WFZUV-4802H紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司），N1100-OSB- 2100旋转蒸腾仪（上海爱朗仪器有限公司）。

理冲生髓饮方中各药（人参、黄芪、淫羊藿、莪术等）均由黑龙江中医药大学榜首隶属医院供给，经黑龙江中医药大学孙慧峰教授判定均契合2015年版《中华人民共和国药典》各药项下规则。对照品人参皂苷Rg1（批号110703-201128）、人参皂苷Rb1（批号110704-201424）、人参皂苷Re（批号110754- 201324）、黄芪甲苷（批号110781-201314）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201304）、淫羊藿苷（批号110737-200415）、宝藿苷Ⅰ（批号111852-201102），我国食品药品检定研讨院；人参皂苷Rd（批号MUST- 11041212），成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈（GR级，美国迪马科技有限公司），磷酸（GR级，天津赛孚瑞科技有限公司），HPLC所用水为屈臣氏蒸馏水，试验用水为重蒸馏水，其他试剂均为剖析纯。

2 办法与成果

2.1 理冲生髓饮的制备

取处方量饮片，以超临界流体萃取法（SCFE）萃取，取得萃取物；药渣持续以适合浓度乙醇回流提取，提取液收回乙醇后浓缩至适量；药渣挥尽溶剂后，持续以水回流提取，水提液浓缩后，与上述浓缩液兼并，参加萃取物，搅匀，即得。本研讨选用正交试验法优化其间的醇提工艺。

2.2 干膏得率测定

取1/10正交试验取得的提取液，置枯燥至恒重

的蒸腾皿中，水浴蒸干后，置105 ℃烘箱中枯燥至恒重，在枯燥器中冷却30 min，精细称定，核算干膏得率。

2.3 黄酮类和皂苷类成分检测

2.3.1 对照品溶液的制备 精细称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg毛蕊异黄酮葡萄糖苷、1.00 mg淫羊藿苷、0.50 mg宝藿苷Ⅰ的混合对照品贮备液。精细称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg人参皂苷Rg1、2.0 mg人参皂苷Re、1.0 mg人参皂苷Rb1、1.0 mg人参皂苷Rd和1.0 mg黄芪甲苷的混合对照品贮备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 正交试验取得的提取液，减压收回乙醇后加水涣散，然后用乙酸乙酯萃取至无色，兼并乙酸乙酯层，减压收回乙酸乙酯后，加甲醇溶解，过滤，即得。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 别离按处方份额称取除黄芪、淫羊藿，除黄芪、人参之外的其他药味，按“2.1”项下办法制备缺黄芪、淫羊藿阴性对照溶液和缺黄芪、人参阴性对照溶液。

2.3.4 色谱条件 选用Dikma Diamonsil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），活动相为0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（见表1），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量20 ?L，检测波长为270 nm（黄酮类成分）、203 nm（皂苷类成分）。

2.3.5 体系适用性试验 别离取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液和空白甲醇，按“2.3.4”项下色谱条件进样，记载色谱图（见图1、图2）。各首要色谱峰与其左右峰的别离度均大于1.5，理论塔板数均大于7000。

2.3.6 线性关系调查 按逐级稀释法，别离精细汲取适量混合对照品溶液于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得混合对照品系列溶液，按“2.3.4”项下色谱条件进行测定，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得到各成分的回归方程。毛蕊异黄酮葡萄糖苷：Y=5.0E+7X-984 485，r=0.999 9，在0.25～2.5 ?g范围内线性关系杰出；淫羊藿苷：Y=3.0E+7X+45 106，r=0.999 8，在1.0～10.0 ?g范围内线性关系杰出；宝藿苷Ⅰ：Y=7.0E+7X+69 274，r=0.999 8，在0.5～5.0 ?g范围内线性关系杰出。人参皂苷Rg1：Y=1.0E+7X-35 999，r=0.999 6，在1.0～10.0 ?g范围内的线性关系杰出；人参皂苷Re：Y=1.0E+7X+47 082，r=0.999 7，在2.0～20.0 ?g范围内线性关系杰出；人参皂苷Rb1：Y=1.0E+7X+112 642，r=0.999 7，在1.0～10.0 ?g范围内线性关系杰出；人参皂苷Rd：Y=1.0E+7X-88 267，r=0.999 7，在1.0～10.0 ?g范围内线性关系杰出；黄芪甲苷：Y=1.0E+7X-10 578，r=0.999 8，在1.0～10.0 ?g范围内线性关系杰出。

2.4 醇提工艺优化

2.4.1 提取次数 取处方量药材，调查提取次数对醇提工艺的影响。成果标明，提取次数对醇提工艺的影响较大。提取2次与提取1次比较，各成分搬运率及干膏得率均较高，当提取次数添加至3次时，各成分搬运率无明显改变，见表2。为削减溶剂的耗费，节约提取时刻，故挑选提取次数为2次。

2.4.2 正交试验 以乙醇浓度（A）、提取时刻（B）、提取温度（C）、溶媒用量（D）作为自变量要素，选用L9（34）正交试验，以多目标归纳加权评分办法断定最佳醇提工艺。设定满分为100分，干膏得率及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ搬运率标准化数据的权重系数为10，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和黄芪甲苷搬运率标准化数据的权重系数为12。归纳评分=10×干膏得率ib+10×毛蕊异黄酮葡萄糖苷搬运率ib+10×淫羊藿苷搬运率ib+10×宝藿苷Ⅰ搬运率ib+12×人参皂苷Rg1搬运率ib+12×人参皂苷Re搬运率ib+12×人参皂苷Rb1搬运率ib+12×人参皂苷Rd搬运率ib+12×黄芪甲苷搬运率ib。其间i=1，2，3，…，9；目标ib为以各目标的最大值作为参照对该目标各数据进行标准化处理后的值，即目标ib=目标i÷目标max。正交试验要素水平见表3，正交试验成果见表4、表5，方差剖析见表6。

直观剖析成果标明，4个影响要素的主次次序为D（溶媒用量）>C（提取温度）>A（乙醇浓度）>B（提取时刻），最佳工艺A1B2C3D3。方差剖析成果标明，取离均差平方和最小项（B）作为差错估量，用以查验其他要素效果的明显性。成果标明，4个影响要素的主次次序仍为D（溶媒用量）>C（提取温度）>A（乙醇浓度）>B（提取时刻），其间，要素D有极明显影响（P<0.01），要素C和A有明显影响（P<0.05）。终究断定理冲生髓饮的最佳工艺为A1B2C3D3，即：参加10倍量60%乙醇浸泡2 h，加热回流提取2次，提取时刻1.5 h，提取温度80 ℃。

2.4.3 最佳工艺验证 取处方量药材，按“2.4.2”项下最佳工艺条件进行验证性试验，别离测定理冲生髓饮干膏得率及毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷的搬运率，成果见表7。成果标明，该工艺各目标成分提取均较彻底，且重复性好、可行性高。

3 评论

理冲生髓饮由人参、黄芪、淫羊藿、莪术等8味中药组成。2015年版《中华人民共和国药典》（一部）人参、黄芪、淫羊藿药材项下别离以人参皂苷Rg1、Re、Rb1及黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷为含量测定目标[15]。现代研讨亦标明，上述成分均具有不同程度的按捺肿瘤效果[8-13]。此外，人参皂苷Rd具有明显的抗癌活性[14]。故本研讨选用毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、黄芪甲苷的搬运率和干膏得率为目标，并选用归纳加权评分法，依据各有用成分对肿瘤按捺效果的奉献巨细，进行归纳评分，使其能够更合理、更客观、更全面地点评理冲生髓饮的醇提工艺。

本试验参阅2015年版《中华人民共和国药典》（一部）人参、黄芪、淫羊藿药材项下含量测定办法[15]和文献中报导的HPLC剖析办法[16-17]，经过预试验调查了不同供试品制备办法、不同活动相组成、不同检测波长等对理冲生髓饮醇提液剖析效果的影响，终究断定供试品用乙酸乙酯处理，活动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈，检测波长为270 nm（黄酮类成分）、203 nm（皂苷类成分）。该办法不仅能一起测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ这3种黄酮类成分，还能一起测定人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd及黄芪甲苷这5种皂苷类成分，并选用同一PDA检测器完成了3种黄酮类和5种皂苷类成分的一起测定，从而为进一步树立理冲生髓饮质量标准奠定了杰出的根底。

单要素试验标明，在相同的提取工艺条件下，提取次数为2次以上，黄酮类和皂苷类成分含量改变不明显，故挑选提取次数2次。以乙醇浓度、乙醇用量、提取温度、提取时刻4个要素为自变量，选用L9（34）正交试验，以归纳加权评分法为点评根底，终究断定醇提最佳工艺，即：将SCFE萃取后的药渣加60%乙醇浸泡2 h，80 ℃加热回流提取1.5 h，提取2次，兼并提取液减压浓缩至适量。该工艺具有提取率高、安稳性好的特色。

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（收稿日期：2016-09-08）

（修回日期：2016-09-21；修改：陈静）