LC-MS LC—MS/MS一起测定痛安注射液中13个成分的含量
尚婵+李孟璇+李海波+何亮伟+孟兆青+黄文哲+王振中+丁岗+杨中林+萧伟
[摘要] 使用超高效液相色譜-质谱联用仪 （UPLC-MS/MS） 树立了一起测定痛安注射液（TAI）中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱共13个有用成分的定性定量检测办法，用于痛安注射液的质量操控。选用Agilent Zorbax SB-Aq C18柱 （2.1 mm×150 mm，3.5 μm） 色谱柱，活动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱（0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min-1，柱温25 ℃；电喷雾离子源 （ESI） 正离子条件下检测，多反响离子监测 （MRM） 进行定量。成果所测上述 13个待测成分在测定的质量浓度范围内均具有杰出的线性关系 （r>0.999 0）；加样回收率在 95.70%～104.8%，RSD 均小于1.9%，10个批次样品中上述13种成分的质量浓度顺次为0.021 2～0.029 0，0.001 7～0.002 3，0.000 9～0.001 3，5.952～6.205 2，0.195 4～0.240 5，0.002 0～0.002 9，0.693～0.798 2，0.069 3～0.078 2，0.089 29～0.102 9，0.386 5～0.420 1，0.014 3～0.015 9，0.755 3～0.842 1，0.008 2～0.011 2 g·L-1。经办法学验证，该办法简洁、快速、精确、重复性好，可认为归纳点评痛安注射液的质量供给参阅。经过对10个批次的痛安注射液进行剖析测定，并依据含量测定成果标明不同批次痛安注射液的质量并无显着差异，从而为痛安注射液的质量操控供给依据。
[关键词] 痛安注射液； 超高效液相色谱串联质谱法； 生物碱； 黄酮； 木脂素； 中药多成分剖析
[Abstract] The aim of this study was to develop a simple， sensitive ultra performance liquid chromatography mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of syringaresinol， N-trans-feruloyltyramine， chelerythrine chloride， sinomenine， coptisine chloride， sanguinarine， chelidonine， magnolflorine， allocryptopine， protopine， farrerol， stylopine and dihydrosanguin-arine in Tong′an injection （TAI）， which could be used for the quality control of TAI. The UPLC analysis was performed on Agilent Zorbax SB-Aq column （2.1 mm×150 mm，3.5 μm）， with 0.1% formic acid solution （A） -acetonitrile （B） as the mobile phase for gradient elution （0.01-2 min， 5%B； 2-8 min， 5%-30%B； 8-11 min， 30%-95%B； 11-13 min， 95%B； 13-13.1 min， 95%-5%B； 13.1-14 min， 5%B）. The flow rate was 0.5 mL·min-1， and the column temperature was 25 ℃； multiple reaction monitoring （MRM） was performed in electrospray ion source positive ion mode for quantitative determination. The calibration curves for the above thirteen compounds showed good linear relationship in corresponding mass concentration range （r>0.999 0）. The average recovery rate of the compounds ranged from 95.70% to 104.8%， with RSD of less than 1.9%. The contents of thirteen active components in 10 batches of TAI were 0.021 2-0.029 0， 0.001 7-0.002 3， 0.000 9-0.001 3， 5.952-6.205 2， 0.195 4-0.240 5， 0.002 0-0.002 9， 0.693-0.798 2， 0.069 3-0.078 2， 0.089 29-0.102 9， 0.386 5-0.420 1， 0.014 3-0.015 9， 0.755 3-0.842 1， and 0.008 2-0.011 2 g·L-1 respectively. Methodology validation proved that this method was simple， rapid， sensitive and accurate， which can be used to provide reference for the comprehensive evaluation of TAI quality. The determination results of 10 batches of TAI showed the content of each batch had no significant difference. The results may provide a basis for the quality control of TAI.
[Key words] Tong′an injection； UPLC-MS/MS； alkaloid； flavonoids； phenylpropanoids； multi-component analysis of Chinese patent medicine
痛安注射液（Tong′an injection，TAI）处方来源于广州肿瘤医院李瑞甫主任医师供给的临床经验方[1]，该处方由青风藤、白屈菜、汉桃叶3味常用中药材精制而成。白屈菜与青风藤中首要含有生物碱类成分[2-3]；汉桃叶中首要活性成分为有机酸[4]。白屈菜为君药，青风藤为臣药，汉桃叶为佐药，痛安注射液临床上首要用于放化疗或非放化疗的肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤属血瘀引发的癌性中度痛苦[5]。
前期本課题组使用活性追寻辅导别离办法，对痛安注射液抗炎部位进行了体系的化学成别离离，但有些化合物在痛安注射液中含量较少，且色谱峰别离度低，无法经过HPLC测定其含量，为了愈加有用地操控其质量，本研讨树立了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法一起测定痛安注射液中生物碱（N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、次罂粟碱、二氢血根碱）、黄酮类（杜鹃素）、木质素类（丁香脂素）共13 个有用成分的含量，并选用箱线图对不同批次痛安注射液中的13个有用成分进行质量剖析，成果标明所树立的剖析办法安稳、快速、精确、牢靠，可为痛安注射液质量标准的进步供给必定的科学依据。
1 资料
AB API4000+质谱仪（美国 AB 公司），配有三重四极杆线性离子阱质量剖析器，Toubo V 电喷雾离子源；LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有四元泵，自动进样器，二极管阵列检测器和真空脱气机；CHA-S型气浴恒温振荡器（国华仪器）；HSC-24A型氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）；METTLER XS 205微量剖析天平（梅特勒-托利多，瑞士-美国）；ST-16R型高速冷冻离心机（Thermo Fisher）；XW-80A型微型涡旋混合仪（上海沪西剖析仪器厂有限公司）；KQ-500 台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，我国）；甲醇为色谱纯 （Fedia company.Inc.1000 Fedia way）；水为纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，我国），其他试剂均为剖析纯。
对照品N-反式阿魏酰酪胺（批号 140721，纯度≥98%）、血根碱（批号 14082303，纯度≥98%）、白屈菜碱（批号 150706，纯度≥98%）、木兰花碱（批号 151029，纯度≥98%）、别隐品碱（批号150118，纯度≥98%）、原阿片碱（批号 151117，纯度≥98%）、杜鹃素（批号 150115，纯度≥98%）对照品均为成都普菲德生物技术有限公司供给，二氢血根碱（批号 W24M7Z11739，纯度≥98%）、黄连碱（批号 16043033，纯度≥98%）对照品购自上海源叶生物科技有限公司；丁香脂素（批号 BBBP00152，纯度98%）购自云南西力生物生物技术有限公司；次罂粟碱（批号 00019368-326，HPLC≥98%）购自ChromaDex，Inc.；白屈菜红碱（批号 111718-201402，供含量测定用，以80.5%计）、青藤碱（批号 110774-200507，供含量测定用，以100%计）购自我国食品药品检定研讨院。10批痛安注射液（江苏康缘药业股份有限公司出产，批号140601，140706，140823，140903，141025，141115，141216，140309，140407，140520）。
2 办法与成果
2.1 色谱及质谱条件
2.1.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-Aq C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）色谱柱，活动相0.1%甲酸水溶液 （A）-乙腈 （B），梯度洗脱 （0.01～2 min，5%B；2～8 min，5%～30%B；8～11 min，30%～95%B；11～13 min，95%B；13～13.1 min，95%～5%B；13.1～14 min，5%B），流速0.5 mL·min-1，柱温 25 ℃，进样量 1 μL。
2.1.2 质谱条件 选用ESI 源，正离子方式检测，喷雾电压为 4 500 V，离子源温度 500 ℃，雾化气 （GS1，N2），压力为 344.74 kPa；辅佐气 （GS2，N2） 压力为 344.74 kPa；气帘气 （N2） 压力为206.85 kPa。接口加热，全程通入氮气，多反响离子监测方式 （MRM） 定量。13个化合物测定的离子对，去簇电压 （DP） 和磕碰能量 （CE） 见表 1。13 个化合物的提取离子流色谱图见图1。
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液 取痛安注射液2.00 mL，精细量取，置250 mL的量瓶中，50%甲醇定容，摇匀，取以 14 000 r·min-1离心 10 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.2 对照品溶液 别离取丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱对照品适量，精细称定，置 25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度别离为 0.205 6，0.158 8，0.087 2，1.960 0，0.132 0，0.106 0，0.207 6，0.230 0，0.200 4，0.214 0，0.187 2，0.209 2，0.207 6 g·L-1的对照品储藏液，避光4 ℃保存。别离精细量取适量的上述标准储藏液，由50%甲醇定容，配制成系列浓度的标准作业溶液，需现用现配，13 种混合对照品溶液均由储藏液稀释得到。
2.3 办法学调查
2.3.1 线性关系调查 精细量取混合对照品储藏液1 mL，置于25 mL 量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀，作为混合对照品储藏液，按倍率稀释法用50%甲醇稀释配制成一系列浓度的混合对照品溶液。进样前用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，按2.1项办法测定峰面积，以进样浓度 （x） 为横坐标，峰面积 （y） 为纵坐标进行线性回归，别离以信噪比为 10和 3 时各对照品的量作为定量限 （LOQ） 和检测限 （LOD）。 13 个待测组分的进样浓度和峰面积的相关系数 r 均大于 0.999 0，见表 2。
2.3.2 定量限和检测限 取混合对照品溶液，顺次稀释成梯度质量浓度溶液，依照2.1.1和2.1.2项的条件进行剖析测定，以信噪比10倍和 3 倍时的质量浓度为定量限和检测限，见表2。
2.3.3 精细度试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项办法制备供试品溶液，依照2.1.1和2.1.2项的条件平行接连进样剖析6次，别离记载各成分峰面积，核算RSD，成果显现RSD均小于2.1%，均契合精细度试验要求，阐明该仪器精细度杰出。
2.3.4 安稳性试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项办法制备供试品溶液，依照2.1.1和2.1.2项的条件进样剖析，别离于 0，2，4，8，16，24 h 时刻点进样，核算各成分峰面积的 RSD，各成分均小于2.8%，标明供试品溶液在 24 h 内安稳。
2.3.5 重复性试验 取痛安注射液（140601），按2.2.1项办法制备供试品溶液 6 份，依照 2.1.1和 2.1.2项的条件进样测定，记载 13个化合物的峰面积，核算 RSD。成果测定供试品溶液中丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱含量的均匀值 （n=6）质量浓度别离为0.026 0，0.001 7，0.001 3，6.081 3，0.221 3，0.002 7，0.785 1，0.074 8，0.094 9，0.420 1，0.015 7，0.808 8，0.009 1 g·L-1，RSD均小于1.9%。均契合规则，标明办法重复性杰出。
2.3.6 加样回收率试验 精细量取同一批次 （批号140601）的痛安注射液1.00 mL，参加混合对照品溶液1.00 mL（丁香脂素0.050 g·L-1、N-反式阿魏酰酪胺0.003 6 g·L-1、白屈菜红碱0.002 4 g·L-1、青藤碱 12.200 g·L-1、黄连碱0.463 g·L-1、血根碱0.005 g·L-1、白屈菜碱 1.603 g·L-1、木兰花碱 0.160 g·L-1、别隐品碱 0.179 g·L-1、原阿片碱 0.830 g·L-1、杜鹃素0.040 g·L-1、次罂粟碱1.642 g·L-1、二氢血根碱0.020 g·L-1，在此储藏溶液基础上稀释一倍作为混合对照品溶液），按2.2.1项办法制备供试溶液，进样剖析，并作随行标准曲线核算回收率，成果见表3。
2.4 样品测定
精细量取 10 个不同批次痛安注射液制品，依照 2.2.1项办法制备供试品溶液，每个批次的样品平行制备3份供试品溶液，依照 2.1.1和 2.1.2项的条件进样测定，带入线性回归方程别离核算痛安注射液中 13 个成分含量，成果见表 4。
2.5 箱线图剖析
箱线图是一种描绘数据散布的统计图，使用它能够直观的来调查变量值的散布状况，箱线图首要标明变量值的中位数，1/4位数，3/4位数等统计量。在现有的研讨基础上，引入了P来点评批次间的差异，P=CA/CB×100，其间CA为每个批次各个化合物的测定浓度，CB为10个批次各个化合物的均匀测定浓度。P越接近于100%标明批次间的差异越小，规则批次间的动摇在75%～125%是能够承受的[7]。选用 SPSS 20.0 数据处理软件对测定成果进行处理，对痛安注射液10批次中的13个化学成分进行剖析，见图2。化合物4与12别离有一个异常值。由此能够得出不同批次痛安注射液的质量并无显着差异，从而为痛安注射液的质量操控供给依据。
3 评论
3.1 测定办法的挑选
现在关于痛安注射液中化学成分的测定，多选用高效液相色谱测定，要求各种成分色谱峰彻底别离，剖析时刻较长，且关于含量较少，色谱别离度低的化合物无法快速精确测定。前期对痛安注射液有用成分含量测定的报导，多集中于其间2个或几个成分的测定，其他有用成分的含量测定办法还未树立[8-9]。本课题组前期运用现代化学-药理学相结合的办法对痛安注射液进行了体系的化学成分剖析研讨，别离判定了21个化合物，并选用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型对所别离到的21化合物进行了PGE2按捺活性检测，发现丁香脂素、N-反式阿魏酰酪胺、白屈菜红碱、青藤碱、黄连碱、血根碱、白屈菜碱、木兰花碱、别隐品碱、原阿片碱、杜鹃素、次罂粟碱、二氢血根碱对PGE2有很好的按捺效果。本研讨经过对离子扫描方式的探索，发现这13个化合物在正离子扫描方式下呼应高，峰形好，故本研讨选用多反响离子监测方式，一起测定痛安注射液中 13个有用成分含量。因为质谱选用单离子扫描方式，樣品中其他物质对待测成分搅扰小，且色谱别离度对检测影响不大，能够在短时刻内完成有用别离。
3.2 活动相的挑选
活动相中的有机相一般可选用甲醇或乙腈，13个化合物中11个化学成分为生物碱，而生物碱成分均含有N 原子，呈弱碱性，对pH较活络，pH较低时会以结合状况存在，pH较高时会以游离状况存在，所以活动相中的pH 要到达必定的酸度，使生物碱以一种状况方式存在，才会取得杰出的峰形，故在活动相中参加适量甲酸，有助于[M+H]+的构成，可进步呼应，改进峰形，试验调查了0，0.05%，0.1% 的甲酸水溶液关于剖析物的呼应及峰形的影响，发现0.1%甲酸水溶液峰形最好，考虑到色谱柱的使用寿命，0.1%甲酸水溶液的pH约为4，该色谱柱能够耐受这样的酸度，故选用了0.1%甲酸水溶液。有机相甲醇与乙腈关于峰形的影响不大，而且前期在运用UPLC-Q/TOF-MS办法对痛安注射液定性的研讨中有机相选用乙腈[10]，所以本课题组选取了乙腈-0.1%的甲酸水溶液作为活动相。
3.3 定量重复性
依据对惯例则量重复性的一般规则RSD≤2.0%，但与UV及HPLC等比较，质谱定量剖析活络度高，但重复性一般较差，很难到达药物制剂日常定量的要求。因此为确保本办法定量重复性应确保仪器状况安稳，操作标准，削减操作差错；挑选适宜的离子对，呼应好；在答应范围内，尽量进步样品浓度。
4 小结
本试验选用 LC-MS/MS以乙腈-0.1%甲酸水溶液为活动相，梯度洗脱，14 min即可快速别离痛安注射液中13个有用成分，该办法简略、活络、精确，可为该药的全面质量操控供给科学依据。该办法的精细度、安稳性、重复性及回收率均较好，耗时短，一起剖析13个成分，而且其间最小的檢测限为0.048 462 mg·L-1，可用于含量较低的活性成分的相关研讨，有利于进一步完善痛安注射液及其类方的质量操控及相关研讨。
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[责任编辑 孔晶晶]