酵母细胞 高产橙花叔醇的酵母细胞工厂创立
张丽丽 马晓琳 王冬 郁彭 黄璐琦 张学礼 戴住波
[摘要]橙花叔醇为萜类精油成分，具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种生物学活性。为了实现在酿酒酵母中异源出产橙花叔醇，该研讨首要将猕猴桃Actinidia chinensis来历的橙花叔醇合酶（NES）基因经过密码子优化、人工组成后转入底盘菌株FPP001中取得工程菌株NES001，其橙花叔醇产值到达271 mg·L-1。在进一步工作中，橙花叔醇合酶的N端经过衔接肽GGGS 交融法尼烯合酶（FPS）后得到橙花叔醇产值明显进步的工程菌NES002，其产值是NES001的5980倍，到达16207 mg·L-1。终究，经过康复NES002中色氨酸生物组成缺点基因TRP1得到工程菌NES003，该菌在高密度发酵系统中橙花叔醇产值能到达1 71153 mg·L-1。该研讨为微生物发酵法出产橙花叔醇等倍半萜化合物供给了根底。
[关键词]精油；橙花叔醇；组成生物学；酿酒酵母
Construction of cell factories for high production of nerolidol
in Saccharomyces cerevisiae
ZHANG Lili1，2，3， MA Xiaolin1，2，3， WANG Dong2，3， YU Peng1， HUANG Luqi4， ZHANG Xueli2，3*， DAI Zhubo2，3*
（1 College of Biotechnology， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457， China；
2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；
3.Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；
4 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，
China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
[Abstract]Nerolidol is an important constituent of terpenoid essential oil and has excellent antitumor， antibacterial， and antioxidative properties For realizing heterogenous production of nerolidol， our research firstly integrated the codonoptimized Actinidia sinensis nerolidol synthase gene （NES） into the terpenoid chassis strain FPP001， and obtained NES001 that could produce 271 mg·L-1 nerolidol Then， the Nterminal of the NES was fused with FPS by linker peptide GGGS With this strategy， nerolidol production improved by 5980fold， reaching 16207 mg·L-1 Finally， by introduction of auxotrophic marker TRP1 in NES002， the resulting strain NES003 could produce 1 71153 mg·L-1 by high cell density fermentation method This study provides the basis for the fermentative production of nerolidol and other sesquiterpenoids
[Key words]essential oils； nerolidol； synthetic biology； Saccharomyces cerevisiae
橙花叔醇（nerolidol）是具有芳香性的倍半萜精油成分[1]，首要存在于中藥降香，陈皮等100多种香料植物中[2]。因为橙花叔醇特别的香味，可用于制造玫瑰型、紫丁香型等多种花香型日化香精，被广泛应用于化妆品和洗刷范畴；一起橙花叔醇具有抗疟疾[3]，抗肿瘤[4]，抗溃疡[5]，抗氧化[6]和抗菌[7]等多种生物活性，已被美国食物和药物管理局同意作为食物调味剂[8]。现在，橙花叔醇的传统取得办法是从植物精油中浓缩、浸取而得，因为该办法存在提取功率低、糟蹋植物资源、破坏生态环境等问题，不符合可持续开展的要求[9]。
近年来，运用组成生物学的原理，规划和改造微生物菌株来出产青蒿素，人参皂苷等中药有用成分已被认为是一种很有潜力的办法[1012]。酿酒酵母因为其遗传布景明晰、遗传改造技能和发酵办法老练，现已被广泛应用到构建组成萜类化合物的底盘菌中。在酿酒酵母中，乙酰辅酶A在MVA途径7个酶的催化下，可生成一切萜类化合物组成的前体物质异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在倍半萜化合物生物组成途径中，IPP和DMAPP可在法呢基焦磷酸组成酶（FPS）的效果下生成倍半萜类化合物的组成前体法呢烯基焦磷酸（FPP），FPP可在不同倍半萜组成酶的催化效果下生成橙花叔醇等各种倍半萜化合物，见图1。endprint
实验室前期，已构建了1株过表达MVA途径7个基因的底盘菌株NK2SQ，其可明显添加酿酒酵母内萜类化合物的组成通量[11]。在本研讨中，底盘菌株NK2SQ中参加乙醇组成乙酰辅酶A的乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合酶（ACS1）等酶基因的表达调控，猕猴桃Actinidia chinensis来历的橙花叔醇合酶（NES）基因（GenBank： JN2422431）密码子优化，NES与FPS酶蛋白交融，以及高密度发酵等战略进一步用于进步细胞工厂组成橙花叔醇的才能。相关成果为微生物发酵法出产橙花叔醇等倍半萜化合物奠定了根底。
1资料
11东西酶与试剂PrimeSTAR HS DNA聚合酶购自于大连宝生物工程公司；酵母基因组DNA提取试剂盒购自北京康为世纪有限公司；质粒小量快速提取试剂盒购自美国Axygen公司；氨苄青霉素、DNA清潔试剂盒与DNA收回试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母挑选培育基购自北京泛基诺科技有限公司；麦角固醇、鲨烯和橙花叔醇规范品购自美国SigmaAldrich公司；其他试剂均为剖析纯。
12质粒，菌株及引物本次研讨所用的质粒，菌株及引物信息见表1，2。
HMGCoA 3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A； IPP isopentenyldiphosphate； DMAPP dimethylallyldiphosphate； FPPfarnesyl pyrophosphate； ERG10 acetoacetylCoA thiolase； ERG13 HMGCoA synthase； HMG1 HMGCoA reductase； ERG12 mevalonate kinase； ERG8 phosphomevalonate kinase； ERG19 mevalonate pyrophosphate decarboxylase； IDI1 isopentenyl diphosphate isomerase 1； ERG20 FPP synthase； ADH2alcohol dehydrogenase； ALD6 acetaldehyde dehydrogenase； ACS1 acetylCoA synthetase； NES nerolidol synthase。
13培育基LB培育基：1% 蛋白胨，05% 酵母粉，1% 氯化钠，100 mg·L-1氨苄青霉素；SMUra挑选培育基：08% 酵母挑选培育基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001% Trp，0005% His；SMUraHis挑选培育基：08% 酵母挑选培育基（三缺，UraTrpHis），2% 葡萄糖，001%Trp；SMUraHisLeu挑选培育基：08% 酵母挑选培育基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖，001% Trp。SMUraHisLeuTrp挑选培育基：08% 酵母挑选培育基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖。上述液体培育基加2% 的Agar可配成相应的固体培育基。
高密度发酵培育基和补料培育基参照人参皂苷高密度发酵培育基配方制造[12]。
2办法
21FPP001菌株的构建构建FPP001工程菌株所选用的办法为多片段同源重组。首要，模板和引物的调配计划见图2和表3，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增和割胶收回得到用于同源重组的各
个片段。用SMUra培育基活化NK2SQ后将各个片段转入醋酸锂办法制备的感受态中，并用SMUraHis固体培育基挑选转化子。转化子再别离用SacⅡPGK1/ADH2Asc1，PacpTDH3/ACS1Asc1，SacⅡpTEF1/ALD6Asc1等 3对引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌FPP001。
22NES系列菌株的构建用醋酸锂的办法制备FPP001感受态细胞，将质粒pRS313NES转入FPP001感受态细胞，并用SMUraHisLeu固体培育基挑选转化子。转化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物进行PCR验证和测序验证后，得到工程菌NES001。
用醋酸锂的办法制备FPP001感受态细胞，将质粒PRS313FPSGGGSNES转入FPP001感受态细胞，并用SMUraHisLeu固体培育基挑选转化子。转化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物进行PCR验证和测序，得到工程菌NES002。
以ZDTRP1intergup/ZDTRP1intergdown为引物，BY4742基因组为模板，运用 PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增和割胶收回得到用于同源重组的片段TRP1。用醋酸锂的办法制备NES002感受态细胞，将片段TRP1转入NES002感受态细胞，并用SMUraHisLeuTrp固体培育基挑选转化子。直接将转化子进行测序，得到工程菌NES003。
23发酵及产品提取摇瓶发酵：挑取平板上的单克隆于相应液体培育基中，30 ℃，250 r·min-1过夜制备种子液。将种子液接种以1%的接种量接种于含15 mL相应液体挑选培育基的100 mL三角瓶中，30 ℃，250 r·min-1振动培育1 d，然后参加15 mL正十二烷，持续震动培育6 d。终究，将三角瓶中液体转移至50 mL离心管，5 000 r·min-1离心5 min，搜集有机相，用正己烷稀释10倍，过有机尼龙膜（022 μm）后备用。
高密度发酵：经火焰接种环，将300 mL种子液参加含3 L发酵培育基的7 L发酵罐中。发酵过程中参数设定值别离为：温度30 ℃，pH 50，溶氧30%，空气流量3～20 L·min-1，拌和转速300～1 000 r·min-1，溶氧与拌和转速、通气相偶联。补料战略为：溶氧值大于60%时，向发酵罐中参加补料培育基至发酵液中葡萄糖浓度为10 g·L-1。尾气管通入含有300 mL正十二烷的吸收瓶，发酵112 h后向发酵罐中参加200 mL正十二烷，500 r·min-1拌和1 h，搜集有机相，用正己烷稀释100倍，过有机尼龙膜（022 μm）后备用。endprint
24橙花叔醇、麦角固醇及鲨烯的检测正己烷制造橙花叔醇，麦角固醇和鲨烯对照品溶液，运用GCMS进行样品的定性和定量剖析[12]。橙花叔醇GCMS测定条件：进样口温度250 ℃，进样体积1 μL，不分流，溶剂延时3 min；色谱柱：HP5ms （025 mm×30 m）；色谱条件：45 ℃，1 min，10 ℃·min-1到300 ℃保温5 min；MS条件：Full Scan： 50～750 amu。麦角固醇和鲨烯GCMS测定条件：进样口温度300 ℃，进样体积1 μL，不分流，溶剂延时12 min；色谱柱：HP5 ms（025 mm×30 m）；色谱条件：80 ℃，1 min；20 ℃·min-1到300 ℃保温18 min；MS条件：SIM69，109，135，363，411。
3成果与剖析
31橙花叔醇酿酒酵母细胞工厂创立及产品判定橙花叔醇组成酶基因（NES）能以酿酒酵母中生成的FPP为底物组成方针产品橙花叔醇，见图1。实验室前期，已构建了1株过表达MVA途径7个基因的底盘菌株NK2SQ，其可明显添加酿酒酵母内萜类化合物的组成通量[11]。为了进一步强化底盘菌的功用，底盘菌株NK2SQ中参加乙醇组成乙酰辅酶A的乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）和乙酰辅酶A合酶（ACS1）等3个酶基因被过表达：PCR克隆得到的ADH2，ACS1，ALD6基因别离与相应的强启动子PGK1，TDH3，TEF1和终止子衔接后，运用同源重组一次整合到NK2SQ基因组的NDT80位点，见图2。转化子经过缺点培育基的挑选、PCR和测序验证后得到倍半萜类化合物底盘菌FPP001，PCR验证成果见图3A。
AFPP001 PCR验证图；BNES001 PCR验证图；CNES002 PCR验证图；MTrans 2K plus marker；A图中泳道1～3别离是3个基因及相应的启动子的PCR验证图，泳道4～6为对照菌PCR验证图； B图中泳道1～2别离是NES001和对照菌PCR验证图；C图中泳道1～2别离是NES002和对照菌PCR验证图。
在此根底上，将人工组成的NES基因置于强启动子TEF1下取得质粒pRS313NES，再将pRS313NES转入到酿酒酵母底盘菌FPP001中，转化子经缺点培育基的挑选，PCR与测序验证后得到工程菌NES001，见图3B。底盘菌FPP001和工程菌NES001在缺点培育基中发酵6 d后，运用GCMS对发酵产品进行定性和定量剖析，发现工程菌株NES001能在1460 min呈现与反式橙花叔醇对照品相同质谱图的新峰见图4，其产值为271 mg·L-1，见图5。
A Nerolidol 代表橙花叔醇对照品，FPP001代表工程菌FPP001发酵产品，NES001代表工程菌NES001发酵产品； B反式橙花叔醇规范质量谱图； C工程菌NES001发酵产品中橙花叔醇质谱图。
32蛋白质交融办法优化橙花叔醇酿酒酵母细胞工厂生物组成途径上各个酶的空间接近对中心产品的流向有着非常重要的影响。拉近组成途径中的2个（或多个）功用相关的酶的空间间隔，从而在空间上更有利于2个催化反应的进行，能有用进步产品的产值。因而，运用衔接肽将功用相关的酶进行交融，现已成为蛋白质工程优化重要战略[13]。在橙花叔醇的生物组成途径中，法呢基焦磷酸组成酶（FPS）能催化IPP和DMAPP组成NES酶的底物法呢基焦磷酸（FPP）。为进一步进步橙花叔醇的产值，运用衔接肽GGGS将FPS交融到NES酶的N端，转入底盘菌FPP001得到橙花叔醇产值明显进步的工程菌NES002，其产值是初始菌株NES001的5980倍，到达16207 mg·L-1。
工程菌养分缺点基因的康复能进步菌株的发酵功用。在NES002菌株的基礎上，康复了其缺点基因TRP1，转化子经缺点培育基挑选和测序验证后得到工程菌NES003。 NES003在缺点培育基中发酵6 d后，其橙花叔醇产值到达19560 mg·L-1，见图5。较菌株NES002产值进步了2069%。
33NES003高密度发酵进一步进步橙花叔醇产值酵母菌的高密度发酵既可进步产品的出产率，又能充分运用生物反应器的容积和下降别离本钱[12，1415]。本研讨中，运用实验室前期树立的萜类发酵工艺对高产菌NES003进行高密度发酵。工程菌NES003发酵72 h后，细胞成长进入渠道期，112 h时菌的成长A600能到达22517，此刻橙花叔醇的产值达1 71154 mg·L-1，与摇瓶发酵比较，进步了775倍，见图6。其间，发酵尾气中橙花叔醇的含量约占总量的210%，发酵罐和尾气瓶中别离为1 67633，3521 mg·L-1，发酵产品存在必定挥发性。别的鲨烯和麦角固醇等竞争性分支途径的代谢物别离为9410，31564 mg·L-1。
4评论
近年来，蛋白质交融技能现已开展成为一种有用进步方针化合物产值的手法，例如：ZHOU等把SmCPS，SmKSL进行交融，以及BTS1（GGPP合酶），ERG20（FPP组成酶）的交融等办法应用于次丹参酮二烯工程菌的构建，酿酒酵母工程菌次丹参酮二烯的产值到达了365 mg·L-1[16]。ZHAO等经过构建Erg20p（F96WN127W）tVoGES交融酶，并对中心衔接肽和酶次序进行优化，运用其他代谢手法，酿酒
酵母工程菌香叶醇产值到达662 mg·L-1，产值比本来报导的最高香叶醇产值高出了7倍多[17]。本研讨将功用相关的NES和FPS进行交融，将橙花叔醇的产值进步了5980倍，为运用交融蛋白技能进步方针化合物产值供给了强有力的支撑。
在发酵过程中，TRP1养分缺点型挑选符号的缺失会对酿酒酵母的成长表型产生影响，例如运用TRP1功用缺点的NES002进行高密度发酵时，尽管咱们在培育基中添加了适量的色氨酸作为弥补，但其细胞生物量目标A600未超越3000，但是当运用NES003进行发酵时其菌株A600明显进步超越7倍，能够到达22517。别的，工程菌株中竞争性分支途径的代谢物鲨烯的含量一向维持在很低水平，提示代谢流首要流向橙花叔醇组成方向，下一步改造将环绕进步萜类化合物全体代谢流打开。endprint
橙花叔醇是具有怡人香味的萜类精油化合物，在化妆品和食物范畴有广泛应用，现在全球需求范围在10～100 t[18]。运用组成生物学原理，创立人工酵母细胞出产橙花叔醇可为橙花叔醇的制备供给新的来历。本研讨经过底盘菌株优化，外源橙花叔醇合酶的转入，蛋白质交融以及高密度发酵等战略，终究取得可出产1 71153 mg·L-1橙花叔醇的酵母细胞工厂NES003。本研讨为微生物发酵法出产橙花叔醇等倍半萜化合物供给了根底。
[参考文献]
[1]Neves R C，Camara C A.Chemical composition and acaricidal activity of the essential oils from Vitex agnuscastus L （Verbenaceae） and selected monoterpenes[J].An Acad Bras Cienc，2016，88，（3）：1221.
[2]程必强，马信祥，许勇，等.橙花叔醇植物资源及运用的研讨[J].林产化学与工业，1996（2）：22.
[3]Saito A Y， Rodriguez A A M， Vega D S M， et al.Antimalarial activity of the terpene nerolidol[J].Int J Antimicrob Agents，2016，48（6）：641.
[4]Triana J， Eiroa J L， Morales M， et al.A chemotaxonomic study of endemic species of genus Tanacetum from the Canary Islands[J].Phytochemistry，2013，92：87.
[5]Klopell F C， Lemos M， Sousa J P， et al.Nerolidol， an antiulcer constituent from the essential oil of Baccharis dracunculifolia DC （Asteraceae）[J].Z Naturforsch C，2007，62（7/8）：537.
[6]Ferreira F M， Palmeira C M， Oliveira M M， et al. Nerolidol effects on mitochondrial and cellular energetics[J].Toxicol Vitro，2012，26（2）：189.
[7]Braca A， Siciliano T， D′arrigo M， et al.Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil[J].Fitoterapia，2008，79（2）：123.
[8]Chan W K， Tan L T， Chan K G， et al. Nerolidol： a sesquiterpene alcohol with multifaceted pharmacological and biological activities[J].Molecules，2016，21（5）：40.
[9]Galili G， Galili S， Lewinsohn E， et al.Genetic， molecular， and genomic approaches to improve the value of plant foods and feeds[J].Crit Rev Plant Sci，2002，21（3）：167.
[10]Paddon C J， Westfall P J， Pitera D J， et al. Highlevel semisynthetic production of the potent antimalarial artemisinin[J].Nature，2013，496（7446）：528.
[11]林庭庭， 王冬， 戴住波，等.创立酿酒酵母细胞工厂发酵出产羽扇豆醇[J].我国中药杂志，2016，41（6）：1008.
[12]Dai Z B， Liu Y， Zhang X A， et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of ginsenosides[J].Metab Eng，2013，20：146.
[13]Zhao F L， Bai P， Liu T， et al. Optimization of a cytochrome p450 oxidation system for enhancing protopanaxadiol production in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng，2016，113（8）：1787.
[14]尹淑琴， 范艳， 常泓.基因工程菌的高密度发酵研讨[J].安徽农业科学，2007（11）：3175.
[15]Brennan T C， Turner C D， Kromer J O， et al. Alleviating monoterpene toxicity using a twophase extractive fermentation for the bioproduction of jet fuel mixtures in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnol Bioeng，2012，109（10）：2513.
[16]Zhou Y J， Gao W， Rong Q X， et al. Modular pathway engineering of diterpenoid synthases and the mevalonic acid pathway for miltiradiene production[J].J Am Chem Soc，2012，134（6）：3234.
[17]Zhao J Z， Bao X M， Li C， et al. Improving monoterpene geraniol production through geranyl diphosphate synthesis regulation in Saccharomyces cerevisiae[J].Appl Microbiol Biotechnol，2016，100（10）：4561.
[18]Mcginty D，Letizia C S，Api A M.Addendum to frangrance material review on nerolidol（isomer unspecified）[J].Food Chem Toxcol，2010，48（3）：S43.
[責任修改吕冬梅]endprint