茯苓三萜 茯苓不同药用部位中三萜酸类成分HPLC指纹图谱研讨
李红娟+李家春+胡军华+刘威+毕宇安+王振中+萧伟
[摘要] 意图：树立并比较茯苓不同药用部位中三萜酸类成分的HPLC特征指纹图谱，为完善茯苓的质量操控办法供给依据。办法：选用HPLC测定，Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；活动相乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱；检测波长210 nm；体积流量1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；选用SPSS 15.0进行聚类剖析。成果：树立了茯苓不同药用部位中三萜酸类成分的指纹图谱；22批茯苓药材指纹图谱中标示出16个共有峰，办法学调查成果契合指纹图谱技能要求；类似度和聚类剖析成果标明，白茯苓、茯神与赤茯苓中三萜酸成分存在显着差异，赤茯苓中茯苓酸的含量最高。药材的质量产地间无显着差异。定论：该办法安稳牢靠，重复性好，所树立的指纹图谱能有用的点评茯苓药材的质量。
[关键词] 茯苓；HPLC指纹图谱；聚类剖析；类似度
茯苓为多孔菌科真菌Poria cocos （Schw. ） Wolf的枯燥菌核，其味甘、淡，性平，归心、肺、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾、宁心之成效[1]，其化学成分首要有茯苓多糖、茯苓三萜（茯苓酸、土莫酸等） 、树胶、蛋白质和脂肪酸等[2-6]。茯苓始载于《神农本草经》，是闻名中成药“桂枝茯苓胶囊”的原资料之一。传统以为茯苓以云南为道地产区， 但开展人工培养以来， 湖北、安徽等地均也树立了演示产地， 成为茯苓的主产区。为了操控茯苓药材的质量，昝俊峰等对不同产地[7-8]、不同菌种来历[9]的茯苓药材进行了指纹图谱研讨，成果标明，产地对茯苓药材的质量具有重要的影响；张琦等[10-12]对不同药用部位的茯苓药材进行了UPLC指纹图谱研讨，并对药材中的三萜成分进行了定性剖析。可是现有文献报导中的药材或药用部位仅限于茯苓皮、茯苓片与茯苓块，尚无HPLC指纹图谱用于判定白茯苓、茯神及赤茯苓3个不同药用部位的相关报导。为了评论该3个药用部位及产地是否存在显着的化学成分差异，本试验初次对收集到的22批不同产地的白茯苓、茯神、赤茯苓药材中的三萜酸类成分进行了HPLC指纹图谱表征和比较，经过对样品HPLC图谱数据进行类似度点评、聚类剖析和主成分剖析，为全面点评茯苓药材质量供给了依据。
1 资料
Agilent 1200型高效液相色谱仪（包括两元泵、柱温箱、在线脱气机、自动进样器、MWD 检测器）；BP211D 型电子剖析天平（德国Sartorius 公司）；Centrifuge 5415D 高速离心机（德国Eppendorf 公司）；Milli-Q Academic 纯水机（法国Millipore）；KQ-250DB 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。
茯苓酸对照品为克己，经质谱判定，选用峰面积归一化法核算，纯度大于99%；乙腈、三氟乙酸为色谱纯，水为纯化水，甲醇、磷酸、甲酸为剖析纯。
2 办法与成果
2.1 供试溶液的制备
取药材粉末5.0 g，精细称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，浸泡30 min，然后超声处理60 min（功率250 W，频率40 KHz），放冷，滤过，取续液滤25 mL，蒸干（不高于70 ℃），残渣用甲醇溶解，定容至5 mL，离心，即得供试样品。
2.2 色谱条件
Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；活动相0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～30 min，50%～55% B；30～40 min，55%～60% B；40～50 min，60%～65% B；50～60min，65%～70% B；60～70 min，70%～75% B；70～80 min，75%～85% B；80～85 min，85%～90% B；85～90 min，90% B。检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL·min-1；理论塔板数以茯苓酸峰核算不低于4 000。
2.3 茯苓药材
茯苓药材样品见表1，经吴舟执业药师判定为多孔菌科真菌茯苓P. cocos，密封保存于阴凉枯燥处。
2.4 办法学调查
2.4.1 安稳性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下办法制备，依据2.2项下色谱条件在0，2，4，8，12，18，24，28 h别离进样测定，记载色谱图，各色谱峰的相对保存时刻和相对峰面积的RSD别离在0.030%～0.43%和0.35%～4.4%，标明供试品溶液在28 h内安稳。
2.4.2 精细度试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下办法制备，依据2.2项下色谱条件，接连进样6次，各色谱峰的相对保存时刻和相对峰面积的RSD别离在0.030%～0.46%和0.35%～2.1%，标明仪器等整个体系的精细度杰出。
2.4.3 重复性试验 取大别山1白茯苓样品，按2.1项下办法制备，平行制备6份，依据2.2项下色谱条件，别离进样测定，各色谱峰的相对保存时刻和相对峰面积的RSD别离在0.020%～0.33%和0.42%～3.87%，标明该剖析办法重复性杰出。
2.4.4 溶剂峰与滞后峰的调查 测验成果标明溶剂无搅扰，延伸至2倍保存时刻，未见有滞后峰。
2.5 茯苓三萜酸类高效液相色谱指纹图谱的树立
2.5.1 HPLC指纹图谱的树立 精细汲取供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，依据2.2项下色谱条件，记载色谱峰。
2.5.2 不同药用部位不同产地茯苓的指纹图谱比较 选用中药色谱指纹图谱类似度点评体系（2004A 版，国家药典委员会）树立对照指纹图谱。白茯苓药材的对照指纹图谱见图1，茯神药材的对照指纹图谱见图2，赤茯苓指纹图谱见图3。其间共有的典型色谱峰共16个，别离出现在20.609，22.209，23.595，25.500，28.096，31.224，32.033，37.859，41.420，55.007，57.402，60.848，64.605，75.843，77.021，79.245 min。共有峰面积占总峰面积的百分比均在90以上。经过与对照品比照，13号峰为茯苓酸，将其作为参照峰（S），别离求出各峰与其相对保存时刻和峰面积比值，成果见表2，3。endprint
2.5.3 类似度核算 运用“中药色谱指纹图谱类似度点评体系2004A版”软件，核算22批茯苓药材的类似度，成果见表4。
2.5.4 聚类剖析 将22个茯苓药材样品各峰的相对峰面积值导入SPSS 15.0 软件，选用组间比照（ between-groups linkage） 进行聚类，使用欧式间隔（euclidean distance）作为样品的测度，聚类成果见图4。
3 评论
3.1 指纹图谱成果剖析
从22批样品看，白茯苓和茯神样品中4，5，8，11，12，13号峰相对峰高互有差异，可是均较强；而赤茯苓中的强峰出现在1，3，5，6，7，10，11，13，14，16号，依据13号茯苓酸的峰高比照，以赤茯苓中茯苓酸的含量为最高。以茯苓酸的峰为参照峰核算各特征峰的相对保存时刻，其数值不同均较小，阐明不同产地、不同药用部位茯苓药材的成分共同性杰出；但有些特征峰相对峰面积数值的不同却较大，阐明茯苓药材中三萜成分的含量存在显着差异[13-14]。茯苓药材的质量遭到药用部位的影响。赤茯苓与白茯苓、茯神比较，多出一个50.646 min的不知道峰，有待进一步的研讨。
3.2 类似度成果剖析
由表4能够看出茯神药材（Y15～Y21） 类似度最高，达到了0.922 以上； 白茯苓药材（Y1～Y14） 类似度在0.859～0.979，标明同一药用部位、不同产地间药材的类似度较好；白茯苓与茯神之间的类似度在0.198～0.471，与赤茯苓类似度在0.601～0.761，茯神与赤茯苓之间的类似度小于0.345，标明不同药用部位的茯苓指纹图谱有显着差异。湖北大别山产地白茯苓之间的类似度大于0.885，茯神之间的类似度大于0.922；安徽省白茯苓之间的类似度大于0.867，茯神类似度大于0.947，标明同一产地、不同药用部位药材中三萜成分的共同性均较好。
3.3 聚类成果剖析
从树状聚类图中看到，22个样品大致可分为五大类，与药用部位密切相关；榜首大类样品（Y1～Y3，Y5～Y8，Y10～Y13）；第二类（Y4，Y9，Y14）均为白茯苓药材，标明同一药用部位不同产地间差异不大；第三类（Y15～Y19）与第四类样品（Y20，Y21）均为茯神药材，不同产地间存在必定的差异，样品Y22为赤茯苓药材独自聚为一小类，阐明赤茯苓与白茯苓、茯神间存在显着差异。
中医药学以为，茯苓的不同药用部位有着不同的临床使用主治，本试验研讨树立了不同药用部位茯苓药材的HPLC指纹图谱，并选用中药色谱指纹图谱类似度点评体系2004A 版软件对22批药材进行类似度点评，一起使用SPSS 15.0软件对不同药用部位药材进行了归类。类似度的核算是先经过具有足够多的代表性的基准样本的色谱指纹图谱树立共有形式，然后经过样品指纹图谱与共有形式的类似度的核算，供给定性、定量的点评；聚类剖析则是依据很多样本谱图的计算规则对待测谱图进行归类，它所体现的是一种分类的信息。类似度数据处理进程简洁、快速；而聚类剖析在样品分类、特征的提取等方面有优势，本研讨把两者结合起来，发挥各自优势，使茯苓药材质量的点评更全面。
经过办法学验证试验标明，该办法重复性好，可操作性强，可用于茯苓药材的质量操控；不同药用部位茯苓药材的指纹图谱比较成果标明尽管非公有峰和特征指纹峰的比较照例、面积上存在必定的差异，但所含首要成分的类别较共同；从类似度与聚类剖析成果看，不同药用部位间药材的类似度较低，相同药用部位不同产地间药材的类似度较高，标明产地差异性较小，而不同药用部位间差异性较大，这也与中医辩证施治相吻合。
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Study on HPLC fingerprint of triterpene acids in different
medicinal parts of Poria
LI Hong-juan1，3， LI Jia-chun1，3， HU Jun-hua1，3， LIU Wei2，3， BI Yu-an1，3， WANG Zhen-zhong1，3， XIAO Wei1，3*
（1.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd， Lianyungang 222001， China；
2. School of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China；
3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] Objective： To establish an analytical method for the fingerprint of triterpenoid constituents of Poria by HPLC and compare the fingerprints of different medicinal parts of Poria in order to provide basis for controlling Poria quality. Method： The HPLC chromatographic conditions were Waters Symmetry C18 column（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 0.1% phosphoric acid （A） and acetonitrile （B） as gradient mobile phases， flow rate being 1.0 mL·min-1， column temperature at 30 ℃， The detection wavelength was set at 210 nm； The cluster analysis was carried on by SPSS 15.0. Result： The HPLC fingerprints of triterpenoid constituents of Poria were set up. There were 16 common peaks in different medicinal parts. The results of method validation met technical requirement of fingerprints； Triterpenoid constituents in White Poria and Poria cum Radix Pini were different from Poria. The content of pachymic acid was the highest in Poria. The effect of habitat on the quality was no obvious difference. Conclusion： The method is stable， reliable， reproducible， and can be used as an effective means of Poria quality evaluation.
[Key words] Poria； HPLC fingerprint； cluster analysis； similarity
doi：10.4268/cjcmm20142110
[责任编辑 马超一]endprint