查尔酮合成酶 白木香查尔酮合酶（AsCHS1）基因的克隆和生物信息学剖析
汪孟曦，李文兰，张争，魏建和，杨云，徐艳红，梁良
[摘要] 意图：对国产沉香的源植物白木香Aquilaria sinensis查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）基因AsCHS1编码区进行克隆，并对其进行生物信息学剖析和表达剖析。办法：依据已报导的白木香损伤转录组高通量测序成果剖析取得1条具有查尔酮合酶保存结构域的CHS基因序列，选用RT-PCR技能，以不同损伤时刻白木香木质部混合样品总RNA为模板克隆得到白木香AsCHS1的基因编码区序列，并对AsCHS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构猜测剖析。别的，选用qRT-PCR办法，以组蛋白（histones）为内参对AsCHS1基因在损伤钳制下的表达形式进行剖析。成果：序列剖析标明，所克隆的AsCHS1基因编码区开放阅读框（opening reading frame， ORF）长为1 194 bp，编码397个氨基酸残基，命名为AsCHS1。qRT-PCR试验证明该基因表达量在损伤后12 h最大，阐明该基因可以在前期呼应损伤钳制。定论：白木香AsCHS1基因的编码区序列的别离克隆为进一步研讨AsCHS1蛋白在白木香中黄酮组成途径中的功用及表达调控奠定根底。
[要害词] 查尔酮合酶；白木香；黄酮组成
国产沉香为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg含树脂的木材。作为我国传统中药，沉香有具行气止痛、温间断呕、纳气平喘的成效，用于胸腹胀闷痛苦、胃寒吐逆呃逆、肾虚气逆喘急[1]。沉香为极宝贵芳香类药材，因其产值低、价格高，远远不能满意商场的需求。沉香叶的资源丰富，评论沉香叶替代沉香药材的可行性是沉香研讨开发中的一个重要研讨方向。经过对沉香叶提取物的化学成分及药理研讨，沉香叶中含有多糖、黄酮、苷类及酚类等化学成分[2-6]，具有冷静、抗炎、止血、抗肿瘤、抗氧化等药理效果[7]。其间，黄酮类物质，如芫花素、桂花草素等均具有药理活性[8]。组成黄酮类化合物的要害酶之一是查尔酮组成酶（CHS）。经过研讨查尔酮组成酶基因的结构，表达方式，在沉香中的黄酮组成和累积等方面，有助于清晰白木香沉香中黄酮组成的分子机制，探究运用沉香中CHS基因进步沉香中的黄酮含量的可能性。本研讨经过高通量测序取得CHS基因的cDNA全长序列，对其序列特征进行了生物信息学剖析，经过荧光定量PCR技能研讨该基因在处理不一起刻的愈伤安排中的表达及堆集状况，为进一步研讨沉香中黄酮次生代谢调控机制奠定根底。
1 资料
2010年5月于海南省海口市演丰镇收集三年生培养白木香A. sinensis茎（次生木质部已彻底分解），经我国医学科学院药用植物研讨所魏建和研讨员判定，凭据标本保存于我国医学科学院药用植物研讨所海南分所（凭据号2010003）。酒精灯火焰灭菌枝剪，待冷却后全断杆损伤处理2，6，12，24 h后，取全断杆横切面下1 cm厚的茎，剥去树皮后立即用液氮冷冻，存于-80 ℃备用。
大肠杆菌DH Escherichia coli 5α感受态、Taq Plus DNA Polymerase均购自北京天根生化科技有限公司；Total RNA Purification Kit 购于美国LC Science公司； M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，SYBR Premix Ex Taq，pMD19-T载体均为日本宝生物公司产品。本研讨所用引物均由上海生工生物工程技能服务有限公司组成。基因测序由上海英潍捷基交易有限公司完结。
PTC-200型梯度PCR扩增仪（Bio-Rad），Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量仪（Thermo），台式高速离心机（Eppendorf），IQ5荧光定量PCR仪（Bio-Rad），凝胶成像体系（Bio-Rad），制冰机（Sanyo），超低温冰箱（Sanyo），高压蒸气灭菌锅（Sanyo）。
2 办法
2.1 白木香CHS基因的查找和剖析
张争等[9]报导了经过高通量测序办法对三年生的白木香损伤转录组进行了测序拼接，并经过与Swissprot、非冗余核酸数据库（Nt）、非冗余的蛋白数据库（Nr）和京都基因与基因组数据库（Kegg）公共数据库（E≤1×10-5）比对取得了注释成果。依据KEGG注释的基因功用信息，对参加次生代谢的序列（按次生代谢物品种） 进行分类。对一切注释信息收拾，查找黄酮类化合物生物组成途径中的要害酶基因。
2.2 白木香总RNA的提取和cDNA组成
取损伤处理的白木香茎，在液氮中研磨，依据LC Science公司Total RNA Purification Kit试剂盒阐明书提取总RNA，运用NanoDrop 2000进行含量测定和1%琼脂糖凝胶电泳检测。运用TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒将白木香总RNA反转录为榜首链互补链DNA （cDNA）。反转录的反响条件及程序均依照TaKaRa公司的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit试剂盒阐明书进行。
2.3 白木香AsCHS1 基因的克隆
从白木香转录组高通量测序成果中取得1个由7条表达序列标签拼接而成的1 368 bp的序列，经注释剖析发现此片段是具有完好开放阅读框的CHS基因，其开放阅读框为1 194 bp，定名为AsCHS1。依据其两头序列运用Primer软件设计一对引物，序列见表1。以白木香总RNA的反转录产品为模板，依照下列体系对白木香的查尔酮合酶基因进行扩增：cDNA 3 μL， 10×Pfu buffer 5 μL，dNTP （2.5 mmol·L-1） 4 μL，Taq Plus （2.5 U·μL-1） 1 μL，10 μmol 引物各1 μL，终体积为50 μL。反响程序：94 ℃预变性2 min，然后进行30个循环，94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环完毕后72 ℃延伸反响10 min，4 ℃保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产品，切胶收回。将收回的PCR产品与pMD19-T衔接，转化到DH5α菌株，在氨苄抗性平板上进行蓝白斑挑选，再经PCR检测后送上海英潍捷基交易有限公司测序。
2.4 AsCHS1基因信息学剖析
基因的剖析东西AsCHS1基因编码蛋白的理化性质猜测选用ExPASy Proteomics Server供给的在线东西Protparam （http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）；选用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）进行二级结构剖析和结构域的三维建模，氨基酸序列比对运用ClustalW办法进行，经过MEGA 4.0构建Neighbor-joining体系进化树。
2.5 白木香AsCHS1基因在不同损伤处理时刻的表达剖析
运用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）的办法检测白木香愈伤安排中CHS基因在其不同损伤处理时刻（对照CK，2，6，12，24 h）的表达状况。剖析运用SYBR Green I荧光染料法，在qRT-PCR仪上进行。选取白木香Histone基因[10]作为方针基因定量表达的内参基因，引物序列见表1。每个样品设3个重复。反响体系中含有5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L-1） 各0.5 μL，模板（50 mg·L-1） 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，整体10 μL。反响程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s；59 ℃退火/延伸30 s （每次循环后收集荧光），40个循环；95 ℃变性10 s，65～95 ℃做熔解曲线剖析，每个温度以每步0.5 ℃上升，每个温度逗留5 s。试验数据经过Excel进行剖析，取得AsCHS1基因的相对表达量。
3 成果与剖析
3.1 白木香AsCHS1基因挑选
依据序列相似性查找数据库中的序列信息对不知道功用的序列进行注释。对白木香unigenes与核酸和蛋白质数据库（SwissProt，KEGG，Nr，Nt）进行BLASTN程序查找。查找成果发现其间1条contig12370，长1 247 bp，由7条reads拼接而成，具有完好的蛋白编码区，并对其进行了研讨。
3.2 白木香AsCHS1 基因的克隆
依据高通量测序成果，以白木香的cDNA为模板，运用PCR办法扩增取得1个1 194 bp的基因序列，397个氨基酸，GenBank登陆号JX573534。白木香CHS基因PCR扩增成果见图1。基因命名为AsCHS1，将其衔接pMD19-T载体转化到大肠杆菌DH5α，测序成果经NCBI的Blast比对，断定其扩增产品为白木香CHS基因cDNA的片段。
3.3 白木香AsCHS1 基因编码蛋白特性剖析
3.3.1 理化性质 白木香AsCHS1基因全长1 194 bp，编码397个氨基酸，运用ExPASy Proteomics Server供给的在线东西Protparam对基因编码蛋白的理化性质进行猜测，估测该蛋白的分子式为C1939H3093N521O569S14，相对分子质量为43 kD，等电点pI 6.10；带正电残基（Arg+Lys）为40，负电残基（Asp+Glu）为44。该蛋白的不稳定系数为45.07，脂肪系数为98.87，亲水性系数为0.014。
3.3.2 二级结构及三级建模 二级结构在线猜测成果标明，有163个氨基酸参加构成α-螺旋（alpha helix），占一切氨基酸的41.06%，有28个氨基酸参加构成扩展链（extended strand），占总氨基酸的9.57%，还有196个氨基酸参加构成无规则弯曲（random coil），占总氨基酸的49.37%（http：//www.predictprotein.org/）。
运用SWISS-MODEL进行三维结构猜测[11]，经过PyMOL Viewer作图，三维模型见图2。用于树立该模型的氨基酸残基为6～390位，该模型以1cgzA（1.70 A）蛋白[12]为模板，序列同源性为61.8%。
3.4 氨基酸序列比对和基因进化剖析
以AsCHS1序列进行Blast在线序列比对，成果标明AsCHS1基因的核苷酸序列与其他植物CHS基因的相似性较高，运用MEGA 4.0软件，选用邻结法（neighbor-joining， NJ）猜测的白木香AsCHS1与其他代表性植物的氨基酸序列比对，见图3。成果显现，AsCHS1与已取得的白木香CHS有较高的相似性，与葡萄、拟南芥等植物的CHS蛋白相似性达64%。
3.5 白木香AsCHS1在不同损伤处理时刻的表达剖析
为研讨AsCHS1基因在损伤钳制下的表达形式，本研讨选用qRT-PCR别离检测对照CK及损伤处理2，6，12，24 h后AsCHS1基因的表达状况，成果显现该基因在新鲜愈伤中表达量较低，该基因在损伤处理的24 h内表达水平明显升高，在12 h处基因表达量最高，是对照组表达水平的13.12倍，见图4。
4 评论
黄酮类化合物是一类天然次生代谢物，广泛存在于植物中。黄酮在植物的色素堆集，抗钳制，抗菌 及细胞发育与分解中起着重要效果，一起还具有广泛的药理效果，如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血压、维护心脑血管体系等多种生物活性[13]。查尔酮合酶作为黄酮类组成途径中的要害酶，其基因的骤变，缄默沉静或过表达会影响黄酮类物质的组成，对其功用和产值发生必定影响。查尔酮合酶基因的表达受植物激素、养分水平、光照、病原菌及机械损伤等的诱导[14]。本试验以损伤处理的白木香为资料成功克隆了AsCHS1基因全长，并选用生物信息学对其二级结构、三级结构等进行了猜测，发现该基因编码的蛋白具有查尔酮合酶典型保存结构域，估测AsCHS1蛋白可能在白木香具有催化组成黄酮的效果，为进一步研讨AsCHS1在白木香中黄酮组成途径中的功用及判定酶活性位点奠定根底。别的，本试验中qRT-PCR成果标明AsCHS1基因的表达受损伤钳制诱导，其表达量在损伤后12 h最大，这为从分子水平上调控白木香中AsCHS1基因表达量以及进步白木香中黄酮化合物含量供给了根底数据。
[参考文献]
[1] 我国药典.一部[S]. 2010：172.
[2] Chen D， Bi D， Song Y L， et al. Flavonoids from the stems of Aquilaria sinensis[J]. Chin J Nat Med， 2012， 10（4）：287.
[3] Qi J， Lu J J， Liu J H， et al. Flavonoid and a rare benzophenone glycoside from the leaves of Aquilaria sinensis [J]. Chem Pharm Bull， 2009， 57（2）：134.
[4] Ito T， Kakino M， Tazawa S， et al. Quantification of polyphenols and pharmacological analysis of water and ethanol-based extracts of cultivated agarwood leaves [J]. J Nutr Sci Vitaminol， 2012， 58（2）：136.
[5] 冯洁，杨秀伟.白木香叶化学成分的研讨[J].我国中药杂志，2012，37（2）：230.
[6] Dong C， Song Y L， Nie C X，et al. Chemical constituents from Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg [J]. Acta Pharmacol Sin， 2012， 21：88.
[7] 路晶晶，戚进，朱丹妮，等.白木香叶中黄酮类成分结构与抗氧化功用的相关性研讨[J].我国天然药物，2008，6（6）：456.
[8] Hara H ， Ise Y， Morimoto N， et al. Laxative effect of agarwood leaves and its mechanism [J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72 （2）， 335.
[9] 张争，高志晖，魏建和，等.三年生白木香机械损伤转录组学研讨[J].药学学报，2012，47 （8）：1106.
[10] Kumeta Y， Ito M. Characterization of δ-guaiene synthases from cultured cells of Aquilaria， responsible for the formation of the sesquiterpenes in agarwood [J]. Plant Physiol， 2010， 154：1998.
[11] Benkert P， Biasini M， Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models[J]. Bioinformatics， 2011， 27（3）：343.
[12] Ferrer J L， Jez J M， Bowman M E. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis[J]. Nat Struct Biol， 1999， 6： 775.
[13] Majewska-Wierzbicka M， Czeczot H. Flavonoids in the prevention and treatment of cardiovascular diseases [J]. Pol Merkur Lekarski， 2012， 32（187）：50.
[14] 张争，杨云，魏建和，等.环境因子导致的植物防御反响与药用次生代谢物的组成和堆集[J].植物生理学通讯，2009，45（9）：919.
Cloning and bioinformatics analysis of chalcone synthase
（AsCHS1） gene in Aquilaria sinensis
WANG Meng-xi1，2， LI Wen-lan1， ZHANG Zheng2，3*， WEI Jiang-he2，3， YANG Yun3， XU Yan-hong2， LIANG Liang4
（1.Drug Research Institute of Life Science and Environment Science， Harbin University of Commerce， Harbin 150076， China；
2. Institute of Medicinal Plant Development，National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials，
Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；
3. Hainan Branch of Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medicinal Sciences & Peking Union
Medical College， Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine，
Wanning 571533， China； 4. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）
[Abstract] Objective： The study aimed to clone the open reading frame of chalcone synthase （CHS） from Aquilaria sinensis and analyze the bioinformatics and expression of the gene. Method： One unique sequence containing CHS domain was discovered in our previous reported wound transcriptome dataset of A. sinensis. The open reading frame of CHS was cloned by RT-PCR strategy with the template of mixed RNA extracted from A. sinensis stem which treated by different wound time.The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The AsCHS1 expression in calli was analyzed with histone gene as an internal control gene under wound condition by qRT-PCR technique. Result： One unique sequence of CHS， named as AsCHS1， was cloned from A. sinensis. The full length of AsCHS1 cDNA was containing a 1 192 bp ORF that encoded 397 amino acids. The result of qRT-PCR displayed that the highest expression level was at 12 h， which indicated that it was possibly involved in early-stage response to wound. Conclusion： Cloning and analyzing AsCHS1 gene from A. sinensis provided basic information for study the fuction and expression regulation of AsCHS1 in the flavonoids biosynthesis .
[Key words] chalcone synthase； Aquilaria sinensis； flavonoids biosynthesis
doi：10.4268/cjcmm20130202
[责任编辑 吕冬梅]