细胞周期蛋白依赖性激酶 siRNA缄默沉静细胞外信号调理激酶1/2基因协同甲亢宁胶囊对大鼠甲状腺细胞—5细胞增殖的影响
林兰 王秋虹 易泳鑫
摘要：意图 经过甲亢宁胶囊（以下简称“甲亢宁”）协同siRNA搅扰大鼠甲状腺细胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）中细胞外信号调理激酶（ERK）1/2基因，调查并评论甲亢宁对FRTL-5细胞RNA搅扰ERK1/2基因表达及对FRTL-5细胞增殖的影响。办法 将成长状况杰出的FRTL-5细胞分为空白组、阴性对照组、甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组。使用siRNA缄默沉静及甲亢宁协同搅扰FRTL-5细胞的ERK1/2基因，RT-PCR检测ERK1/2 mRNA表达，Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达，CCK8法检测细胞增殖。成果 RT-PCR检测成果显现，空白组和阴性对照组ERK1/2的mRNA表达无显着差异（P>0.05）；与空白组比较，siRNA组和甲亢宁组FRTL-5细胞ERK1/2 mRNA表达显着下降（P<0.01）；与空白组、阴性对照组比较，甲亢宁协同组ERK1/2 mRNA表达显着下降（P<0.01）；Western blott检测成果显现，与空白组、阴性对照组比较，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达相对量显着下降（P<0.01）。转染24、48 h后，CCK8法检测成果显现，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组细胞增殖受按捺，与空白组、阴性对照组比较差异有计算学含义（P<0.01）。定论 甲亢宁对ERK1/2磷酸化起阻断效果，ERK1/2基因被缄默沉静后，对甲状腺细胞增殖有按捺效果，甲亢宁可协同ERK1/2-siRNA按捺FRTL-5细胞增殖。
关键词：甲状腺细胞；细胞外信号调理激酶1/2；甲亢宁胶囊；RNA搅扰；增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0043-04
Abstract： Objective To observe and explore the effects of Jiakangning Capsules on the expression of ERK1/2 gene and proliferation of FRTL-5 by studying the effects of Jiakangning Capsules collaborated with siRNA on interfering ERK1/2 gene in FRTL-5. Methods FRTL-5 cells in good conditions were divided into control group， negative control group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， siRNA interference group， and Jiakangning Capsules group. RT-PCR was performed to detect the expression of ERK1/2 gene in mRNA levels in FRTL-5； Western blotting was performed to detect the expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2； CCK8 method was used to detect cell proliferation. Results RT-PCR results showed that the ERK1/2 mRNA expression of the control group and negative control group were of no significant difference （P>0.05）； compared with the control group， siRNA interference group and Jiakangning Capsules group could inhibit ERK1/2 gene mRNA expression in FRTL-5 （P<0.01）. Compared with the control group and negative control group， the ERK1/2 mRNA expression of Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group decreased obviously （P<0.01）. Compared with the control group and negative control group， the expression of p-ERK1/2， ERK1/2 of Jiakangning Capsules group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group decreased obviously （P<0.01）. At the time of 24 h and 48 h after transfection， according to the results of CCK8， compared with the control group and negative control group， the cell proliferation of Jiakangning Capsules group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group was inhibited （P<0.01）. Conclusion Jiakangning Capsules have blocking effect on the phosphorylation of ERK1/2. After ERK1/2 gene was silenced， the thyroid cell proliferation was inhibited. Jiakangning Capsules can collaborate with ERK1/2-siRNA to inhibit FRTL-5 cell proliferation.
Key words： thyroid cell； ERK1/2； Jiakangning Capsules； RNA interference； proliferation
Graves病（Graves disease，GD）是当时常见的甲状腺疾病之一，临床典型表现为甲状腺肿大、Graves眼病和高代谢症候群等。GD是甲状腺功用亢进症的最常见病因[1]。但临床中使用抗甲状腺药物医治普遍存在复发率高、医治周期长的缺陷[2-3]。现在，临床上对GD发病进程中“甲状腺细胞反常过度增殖”这一关键环节，尚缺少针对性的医治药物[4]。本研讨以细胞外信号调理激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2基由于靶点，针对ERK1/2基因的siRNA特异性片段，选用Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂将其有用地转染入Fisher大鼠甲状腺细胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）细胞内，诱导ERK1/2基因缄默沉静，然后研讨RNAi效应对FRTL-5细胞ERK1/2基因表达的按捺效果及其对细胞增殖的按捺效果，评论GD的医治新策略。
1 试验资料
1.1 细胞
FRTL-5细胞（CRL1468）来源于ATCC细胞库。
1.2 药物及制备
甲亢宁胶囊（以下简称“甲亢宁”），我国中医科学院广安门医院，京药制字Z20063194，批号20151203。将1粒甲亢宁（0.45 g）溶于14.265 mL纯水中，制造成100 mg/mL甲亢宁母液，用0.22 μm滤器过滤至离心管，4 ℃保存。根据前期研讨，用F12彻底培育液将甲亢宁母液稀释成3 mg/mL[5]。
1.3 首要试剂与仪器
ERK1/2 siRNA由上海吉玛公司组成，序列参照文献[6]。ERK1/2siRNA序列：5'-GCCGCCGCCGCC GCCAT-3'，与MAPKmRNA翻译开端部位的17个碱基序列互补；随机核苷酸序列：5'-CGCGCGCTCGCG CACCC-3' Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Invitrogen公司；Trizol reagent RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒及BCA蛋白质定量试剂盒，康为世纪生物公司；CCK8细胞增殖检测试剂，日本同仁公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗体，美国CST公司；F12彻底培育基（GIBCO），0.25%胰酶细胞消化液（杭州吉诺），胎牛血清、缓冲液（Hyclone）。细胞培育箱（日本SANYO公司），LP400型全自动酶标仪（法国巴斯德公司），96孔板（CORNING公司），微量加样器（Eppendorff公司）。
2 试验办法
2.1 分组与转染
将细胞接种于6孔板，每孔接种细胞5×104个。试验分为空白组、甲亢宁组、甲亢宁协同组（甲亢宁+ERK1/2-siRNA）、阴性对照组（NC组）、siRNA组，其间甲亢宁组、甲亢宁协同组、siRNA组为干涉组。空白组、NC组、siRNA组加F12彻底培育基3 mL，其他组加甲亢宁培育液3 mL。参照Lipofectamine RNAiMAX Reagent说明书别离对甲亢宁协同组、NC组、siRNA组进行转染。
2.2 引物的规划与组成
ERK1/2 mRNA序列从genebank查询，使用Oligo6.0软件规划引物，在BLAST进步行同源性剖析。引物序列如下：ERK1-F，5'-CATCCGAGACATCCTC AGAGC-3'；ERK1-R，5'-GGTCGCAGGTGGTGTTGA TA-3'；ERK2-F，5'-AGGTTGTTCCCAAACGCTGA-3'；ERK2-R，5'-AGGTAAGTCGTCCAGCTCCA-3'；内参β-actin-F，5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'；内参β-actin-R，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。
2.3 RT-PCR反响
首要制造反转录反响体系，将上述20 μL反响溶液65 ℃保温5 min，37 ℃ 保温40 min，70 ℃保温10 min。然后制造PCR反响体系。反响条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、60 s读板，共45个循环。以2-ΔΔct标明相对样品初始模板量。
2.4 Western blot检测大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调理激酶1/2蛋白表达
提取细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，室温关闭2 h。别离参加p-ERK1/2、ERK1/2一抗，4 ℃温育过夜，再加二抗37 ℃温育1 h后，胶片曝光，定影，凝胶成像体系剖析。
2.5 CCK8法检测大鼠甲状腺细胞-5细胞增殖
调整FRTL-5细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL（每孔接种细胞约2×104个），转染办法同前。转染2 h后，吸去转染培育基，PBS洗2遍，参加F12彻底培育基，置于细胞培育箱培育。搜集转染24、48 h的细胞，每个时点设6个复孔，每孔加CCK8检测试剂10 μL，于酶标仪450 nm处测定吸光度（OD）值，按CCK8试剂盒说明书进行操作。
3 计算学办法
选用SPSS18.0计算软件进行剖析。试验数据以—x±s标明，选用方差剖析，两两比较选用LSD法，方差不齐者选用近似F查验。P<0.05标明差异有计算学含义。
4 成果
4.1 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调理激酶1/2基因表达的影响
RT-PCR检测成果显现，空白组和NC组ERK1/2 mRNA表达无显着差异；与空白组比较，siRNA组和甲亢宁组能够按捺FRTL-5细胞ERK1、ERK2 mRNA表达显着下降（P<0.01）；与空白组、NC组比较，甲亢宁协同组ERK1/2 mRNA表达显着下降（P<0.01）。成果见表1。
4.2 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调理激酶1/2蛋白表达的影响
Western blot检测成果显现，与空白组、NC组比较，甲亢宁组、siRNA组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平显着下降（P<0.01）；与空白组、NC组比较，甲亢宁协同组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平显着下降（P<0.01）。成果见表2、图1。
4.3 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞增殖的影响
CCK8检测成果显现，与空白组、NC组比较，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组OD值下降，存活细胞较少，FRTL-5细胞增殖较慢，差异有计算学含义（P<0.01），标明经过下调ERK1/2 mRNA表达，可按捺FRTL-5细胞增殖。在24、48 h检测点时，与siRNA组比较，甲亢宁组OD值较大，差异无计算学含义（P>0.05）；在48 h检测点时，与空白组比较，NC组OD值较小，差异有计算学含义（P<0.05），这可能是阴性序列对细胞有必定的毒性效果所造成的。成果见表3。
5 评论
FRTL-5是体外研讨甲状腺生理病理机制的常用模型。FRTL-5细胞的增殖是一个多要素一起效果的杂乱进程。很多体表里试验均已证明ERK1/2是促进细胞增殖的重要细胞信号传导途径[7-8]，ERK1/2自身在细胞增殖中起着重要效果，ERK通路的按捺关于改进甲状腺细胞过度增殖至关重要。我院于1978年开端，经过对很多甲亢患者体系的辨证研讨发现甲亢病程中往往呈现阴虚阳亢之象，阴虚阳亢证型为甲亢的根本证型，然后制备了具有滋阴潜阳化痰散结成效的甲亢宁。方中牡蛎滋阴潜阳、软坚散结为君；玄参滋阴清热生津，佐牡蛎散结为臣；甲状腺肿为痰凝所造成的，当化痰、软坚散结，以连翘、山慈菇加强散结之力。诸药合用，共奏滋阴潜阳、化痰散结之功。30余年的临床实践标明，该药在甲状腺功用亢进医治方面具有杰出的效果[9]。课题组既往研讨标明，ERK1/2是甲亢宁的关键效果靶点，调控ERK1/2蛋白表达可能是甲亢宁调控FRTL-5细胞增殖的关键环节[5]。寻觅一种可高效按捺ERK1/2通路并有用按捺其增殖的办法将大大改进GD患者的预后。本试验将文献已报导的针对ERK1 mRNA、ERK2 mRNA的一起的siRNA 片段转染入FRTL-5细胞，使用 RNAi 技能在基因转录水平阻断ERK信号传导通路。上述成果标明，甲亢宁对ERK1/2的磷酸化起阻断效果，ERK1/2基因被缄默沉静后，对甲状腺细胞的增殖有按捺效果，甲亢宁能够协同ERK1/2-siRNA按捺FRTL-5细胞增殖。
参考文献：
[1] 中华医学会内分泌学分会《我国甲状腺疾病诊治攻略编写组》.我国甲状腺疾病诊治攻略-甲状腺功用亢进症[J].中华内科杂志，2007， 46（10）：876-882.
[2] 司富春，宋雪杰.中医医治甲亢的证候和方药剖析研讨[J].中华中医药杂志，2013，28（11）：3251-3252.
[3] 秦淑兰，邱柳芸，刘小华，等.131I与抗甲状腺药物医治甲状腺功用亢进症的Meta剖析[J].中华临床医生杂志（电子版），2013，7（19）：8799-8803.
[4] 蔡鹄.薯蓣皂苷元对Ad-TSHR-289诱导Graves病模型小鼠甲状腺细胞增殖及免疫功用的影响[D].济南：山东大学，2013.
[5] 孟淑华.中药甲亢宁胶囊对FRTL-5细胞TSHR信号转导通路的效果机制研讨[D].北京：我国中医科学院，2014.
[6] GLENNON P E， KADDOURS S， SALE E M， et al. Depletion of mitogen-activated protein kinase using an antisense oligodeoxynucleo-tide approach downregulates the phenylephrine- induced hypertrophic response in rat cardiac myocytes[J]. Circ Res，1996，78（6）：954-961.
[7] CAMBELL P M. Oncogenic Ras Pushes （and Pulls） cell cycle progression through ERK activation[J]. Methods Mol Biol，2014， 1170：155-163.
[8] WASEEM T， DUXBURY M， ASHLEY S W， et al. Ghrelin promotes intestinal epithelial cell proliferation through PI3K/Akt pathway and EGFR transactivation both converging to ERK1/2 phosphorylation[J]. Peptides，2014，52：113-121.
[9] 林兰，李鸣镝，刘喜明.中药甲亢宁医治阴虚阳亢型甲状腺功用亢进症的临床研讨[J].我国中西医结合杂志，1999，19（3）：144-147.
（收稿日期：2015-12-29）
（修回日期：2016-01-27；修改：华强）