鲨烯合酶 建泽泻鲨烯合酶原核表达、功用验证及其免疫检测研讨

刘青芝+谷巍+吴启南+巢建国+桑晓华+刘琪+王小浩

[摘要] 泽泻鲨烯合酶 （AoSS） 催化法呢基焦磷酸[（farnesyl diphosphate， FPP）]组成鲨烯，是碳源流向原萜烷型三萜生物组成的要害调理酶。为深入研讨AoSS基因的功用及表达，课题组将前期克隆取得的建泽泻鲨烯合酶基因（accession No. JX866770） 的开放阅读框（ORF）构建到原核表达载体 pCzn1上，并在大肠杆菌BL21（Roseta）中进行诱导表达，诱导表达出的交融蛋白首要以包容体的办法存在，经纯化取得高纯度的意图蛋白；以此意图蛋白进行体外酶促反响验证其功用，其成果显现该意图蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性；为进一步研讨其表达规则，在此根底上，运用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化，ELISA检测抗体效价大于1∶51 200，Western blotting 检测标明其具有较好的特异性；用制备得到的抗体免疫检测建泽泻AoSS在不同安排中的表达状况，成果显现建泽泻块茎中AoSS表达最高，其次为叶，根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功用的进一步验证及快速免疫检测办法的树立，为进一步展开AoSS基因功用及其调控的研讨奠定根底，为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的组成生物学运用供给科学根据。

[要害词] 建泽泻； 鲨烯合酶； 原核表达； 功用验证； 免疫检测

[Abstract] Squalene synthase of Alisma orientale catalyzes farnesyl diphosphate （FPP） to form squalene， which is the key regulatory enzyme of the carbon source flow to protostane triterpenes biosynthesis. For further research on the function and expression of AoSS gene， the open reading frame （ORF） of squalene synthase gene （accession no. JX866770） from A. orientale was subcloned into a prokaryotic expression vector pCzn1 and induced the expression of AoSS gene in Escherichia coli BL21（Roseta）. The fusion protein was mainly in the form of inclusion bodies and purified to obtain high purity protein. By verifying its functionality through vitro enzymatic reaction， the results showed that the catalytic protein had the catalytic activity of FPP into squalene. In order to research the expression of AoSS in A. orientale， the purified protein was used to immunized rabbits to prepare polyclonal antibody which was then purified， the titer of the antibody was greater than 1∶51 200 by ELISA detection， and displayed good specificity by Western blotting. The prepared antibody was used for immunoassay of AoSS in different organs of A. orientale， and the results showed that the AoSS expression level was the highest in tubers， followed by leaves， and lowest in root. Successful construction of prokaryotic expression vector， validation of gene functions and establishment of rapid immunoassay lay the foundation for further researches on the function and regulation of AoSS gene， and also provide scientific basis on the application of the protostane triterpenes of A. orientale in the field of synthetic biology.

[Key words] Alisma orientale； squalene synthase； prokaryotic expression； functional identification； immunoassay

澤泻Alismatis Rhizoma为泽泻科植物东方泽泻Alisma orientale的枯燥块茎，具有利水、渗湿、泄热之成效，道地产区为福建^[1-2]。泽泻的首要药效成分为原萜烷型（protostane）四环三萜类^[2-3]，其结构共同，C-10位和C-14位上有β-CH3，C-8上有α-CH3，C-20为S构型，该类成分具有抗高血脂、降血压、抗HIV1、抗癌等明显活性^[4-7]。近期的研讨标明，原萜烷型三萜能促进肝再生和避免ANIT诱导的肝毒性和胆汁淤积^[5-8]，但该类成分在植物体中含量低，散布窄，仅存在于泽泻属等少量植物类群中^[9-11]，约束了其进一步开发运用。生物工程是进步活性成分含量的有用途径之一，而活性物质的生物组成功率与其组成途径中的要害酶密切相关。endprint

植物体内三萜类化合物的生物组成首要经过甲羟戊酸（mevalonic acid pathway，MVA） 途径^[12]，鲨烯合酶（squalene synthase，SS） 可以催化2分子的法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP） 生成1分子的鲨烯，是碳源流向三萜类化合物组成途径的要害调理酶^[13-14]。现在，SS基因从雷公藤Tripterygium wilfordii^[13]、甘草Glycyrrhiza uralensis^[14]、人参Panax ginseng^[15]、睡茄Withania somnifera^[16]、厚朴Magnolia officinalis^[17]等药用植物中已克隆取得。研讨发现，经过诱导睡茄鲨烯合酶的表达，可以进步植物甾醇的含量^[18]；而经过按捺人参鲨烯合酶的表达，可使三萜皂苷的生成量下降^[19]。鲨烯合酶作为三萜类成分生物组成途径的要害酶，在组成途径中发挥重要的效果，而有关建泽泻三萜类成分生物组成鲨烯合酶的研讨除本课题组前期工作外未见报导^[20]。

课题组前期已克隆取得建泽泻鲨烯合酶基因全长AoSS（accession No. JX866770）^[20]，其功用以及在植物体内的表达有待进一步验证与研讨。意图蛋白的获取是研讨其功用的条件，而制备高效价的抗体是研讨蛋白基因表达的重要东西。本研讨经过原核表达取得意图蛋白，运用体外酶促反响验证其功用，并运用取得的纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体，树立快速免疫检测办法，剖析AoSS在建泽泻中不同安排的表达，为研讨AoSS的功用及参加的蛋白翻译调控机制供给了根底资料，一起也为该类资源性成分生物组成途径的说明供给科学根据。

1 资料

1.1 样品 试验用资料采自福建建瓯，经南京中医药大学药学院谷巍教授判定为泽泻科植物东方泽泻A. orientale。取建泽泻的叶、块茎、根分装于冻存管中，在液氮中保存备用。原核表达载体pCzn1购自南京钟鼎生物技能有限公司，转化菌株Escherichia coli DH5α、表達宿主细胞BL21（Roseta）由本试验室保存。

1.2 试剂 DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒购自Axygen公司；T4 DNA连接酶、约束性内切酶、羊抗兔IgG （HRP符号） 购自南京钟鼎生物技能有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、蛋白酶按捺剂（bacteria protease inhibitor cocktail）、FPP购自Sigma公司；Ni2+IDA亲和色谱胶购自Novagen公司；0.22 μm无菌滤器和透析袋购自Millipore公司，其他试剂均为剖析纯；引物组成及测序由上海生工生物工程股份有限公司完结。

1.3 仪器 台式高速冷冻离心机 （Beckman）、Biologic LP层析系统（Bio-Rad）、小型笔直电泳槽Mini-PROTEAN Tetra System （Bio-Rad）、凝胶成像系统（Bio-Rad）、PTC-200基因扩增仪（MJ Research）、Nano-Drop 2000核酸/蛋白定量仪（Thermo）、气质联用仪Agilent7890B-7000C（DB-5MS，0.25 μm×0.25 mm×30 m，Agilent）。

2 办法

2.1 原核表达载体pCzn1-SS的构建 根据提交到NCBI上的建泽泻AoSS基因全长cDNA序列 （accession No. JX866770），找出其完好的ORF序列规划并组成引物，上游引物5′-ATGGAGCTCGACCCGCACC-3′（下划线为SacI酶切位点），下流引物5′-TAATCTAGATAGGTAATCTC-3′（下划线为XbaI酶切位点）。进行PCR扩增，PCR反响系统（50 μL）：10×PCR缓冲液5.0 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 4.0 μL，10 mmol·L-1dNTP 4.0 μL，10 nmol·L-1上下流引物各1.0 μL，cDNA模板5.0 μL，5 U rTaq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 29.5 μL。PCR反响程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环，再72 ℃延伸7 min。PCR产品经琼脂糖电泳检测后，切胶收回PCR意图片段，用SacI和XbaI进行双酶切后，连接到表达载体pCzn1上，然后转入大肠杆菌DH5α，酶切和测序判定阳性克隆。

2.2 AoSS基因的原核表达 将测序正确的重组质粒pCzn1-SS转入表达菌BL21（Roseta）中，筛选出阳性克隆，挑取阳性克隆接入含有50 mg·L-1 Amp的LB培育基中，37 ℃过夜振动培育，按1∶100将过夜菌转接至100 ml 含50 mg·L-1 Amp的LB培育液中，37 ℃振动培育至A600为0.6～0.8时，取出 1 mL留作诱导前的对照，向剩下的培育物中参加IPTG至终浓度为 0.5 mmol·L-1，11 ℃ 220 r·min-1诱导12 h，离心搜集菌体。别离取诱导前菌液，诱导后菌液，诱导后菌液的上清及沉积作为样品，进行 10% SDS-PAGE 电泳剖析。

2.3 重组蛋白的纯化与复性 将诱导表达的培育菌液低温离心10 min，菌体沉积重悬与20 mL裂解缓冲液（20 mmol·L-1Tris-HCl，含1 mmol·L-1 PMSF、bacteria protease inhibitor cocktail，pH 8.0）超声破碎20 min，破碎液12 000 r·min-1 4 ℃离心 20 min，搜集沉积，运用包容体洗刷液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1 EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1% Triton X-100，pH 8.0）洗刷包容体3次，用包容体溶解液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1 DTT，8 mol·L-1尿素 pH 8.0） 按必定份额溶解包容体，4 ℃放置过夜后，15 000 r·min-1离心15 min，将包容体溶解液滴加到20 mmol·L-1 Tris，pH 8.0 缓冲液逐渐成倍梯度稀释，缓慢拌和，至尿素浓度到达0.5 mol·L-1时，将蛋白溶液装入透析袋，于4 ℃ 在20 mmol·L-1 PBS，pH 7.4中透析过夜；进行10% SDS-PAGE 剖析。endprint

2.4 原核表达蛋白体外酶促反响 酶促反响系统^[21]：总系统为200 μL，5 mmol·L-1 FPP，50 mmol·L-1 MgCl2，25 μmol·L-1巯基乙醇，25 μmol·L-1 NADPH，0.8 g·L-1AoSS蛋白纯化产品，pH 7.2 磷酸缓冲液补足，上覆400 μL正己烷，在35 ℃反响2 h，充沛涡悬振动后1万 r·min-1离心，取带着空载体菌液提取的蛋白替代AoSS蛋白，其他组分不变，作为对照组，选用气质联用仪（GC-MS）对催化产品进行检测。GC-MS条件：电离办法EI，电子能量70 eV，载气为氦气，进样口温度260 ℃，120 ℃ 3 min，以15 ℃·min-1升至180 ℃，再以25 ℃·min-1升至260 ℃，坚持25 min。

2.5 多克隆抗体制备及纯化 将纯化蛋白免疫新西兰白兔（2～2.5 kg），皮下免疫400 μg/次，2～3周免疫1次，免疫4次。采血检测，经过直接ELISA办法断定抗血清针对蛋白的效价，待效价大于1∶5万 进行终究采血制备抗血清，并预备纯化。将蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化色谱柱，将所得抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗原抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4 ℃透析过夜，隔日进行浓度、纯度及效价测定。

2.6 多克隆抗体浓度、纯度及效价测定 选用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；经过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色调查纯化抗体的纯度；选用直接ELISA检测抗体效价：用包被液（0.05 mol·L-1碳酸盐缓冲液，pH 9.6）将AoSS稀释至5 mg·L-1，每孔参加100 μL，置于4 ℃中包被过夜。次日每孔参加100 μL 5%的脱脂奶粉，37 ℃孵育1 h，PBST（pH 7.4）洗刷3次；加100 μL倍比稀释的兔抗血清，以阴性血清作为对照，37 ℃孵育1 h，同上洗刷3次。加100 μL HRP符号的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，同上洗刷3次。加底物 TMB室温显色20 min，停止反响后，于450 nm处读取吸光度（A）。

2.7 Western blotting 测定抗体特异性 将纯化的AoSS蛋白和未经诱导的重组菌表达的蛋白经SDS-PAGE后转膜，以纯化的多克隆抗体作为一抗，HRP符号的羊抗兔IgG作为二抗，进行蛋白Western blotting剖析，洗膜增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）进行显影。

2.8 多克隆抗体在建泽泻安排中的免疫检测 别离取建泽泻的块茎、叶及根各200 mg，剪碎参加适量裂解液（运用前加PMSF），匀浆器匀浆，充沛裂解，以制备的多克隆抗体为一抗，β-actin 蛋白作为内参照，取上清进行Western blotting，Image J软件进行灰度定量剖析。

3 成果与剖析

3.1 原核表达载体的构建及判定 运用PCR的办法，将建泽泻鲨烯合酶基因（accession No. JX866770）的ORF刺进到原核表达载体pCzn1的SacI和XbaI酶切位点之间，取得了N端带着有HIS6表达标签的重组表达载体pCzn1-SS （图1A），提取质粒，酶切验证，取得了1条1 500 bp巨细的DNA 片段和1公约5 000 bp的载体片段（图1B），与预期巨细共同；测序成果显现，重组表达载体pCzn1-SS刺进的序列与本课题组克隆的泽泻AoSS基因的ORF序列完全共同，此成果标明，取得了正确的重组原核表达载体pCzn1-SS。

3.2 重组蛋白的诱导表达 将构建好的重组质粒pCzn1-SS转化表达菌BL21（Roseta）中，经过0.5 mmol·L-1IPTG诱导，将IPTG 诱导后的菌体超声破碎，离心后别离取上清和沉积进行SDS-PAGE蛋白电泳剖析，在46 kDa处呈现1条预期巨细的特异性条带，与猜测的蛋白分子量相吻合，标明已表达出交融蛋白AoSS，且蛋白存在于沉积中，为包容体蛋白（图2A）。

3.3 重组蛋白的纯化及复性 超声破碎表达菌后离心搜集包容体，用包容体洗刷液洗刷除掉杂质，然后选用8 mol·L-1尿素使包容体变性溶解，逐渐成倍梯度稀释尿素浓度使其蛋白复性，SDS-PAGE检测取得单一意图条带，成果标明取得纯度较高的鲨烯合酶重组蛋白（图2B）。

3.4 蛋白酶促反响产品剖析 取纯化的鲨烯合酶重组蛋白进行体外酶促反响，催化产品经正己烷萃取后用GC-MS剖析，成果显现催化的产品单一，样品的保存时刻（RT）在18.901存在特征峰，而对照中并未检测到相应的特征峰，根据GC-MS联用仪所得质谱信息与文献中的标准谱图对照剖析^[17，21]，由此断定该催化产品为鲨烯（图3）。此成果标明，经RACE办法克隆的全长cDNA编码的建泽泻鲨烯合酶具有催化FPP生成鲨烯的活性。

3.5 多克隆抗体浓度、纯度及效价测定 运用纯化的蛋白免疫新西兰兔，制备AoSS多克隆抗体并纯化，测得抗体浓度为0.22 g·L-1，其纯度在 95%以上（图4A）。以纯化的交融蛋白为包被抗原，抗血清以500～512 000倍数稀释，按酶标仪检测的A450大于阴性对照A450的2.1倍时，则判为阳性，其成果显现抗体效价在1∶512 000以上。

3.6 Western blotting 测定抗体特异性 选用Western blotting对纯化的多克隆抗体进行特异性检测，检测成果显现制备的抗体可特异辨认方针抗原，而未经诱导的重组菌表达的蛋白未见信号（图4B），标明制备的AoSS多克隆抗体特异性好。

3.7 建泽泻安排中AoSS蛋白的免疫检测 选用制备的抗体对建泽泻不同安排中的AoSS蛋白进行检测。AoSS在块茎和叶中均有表达（图5A），而根中表达甚微。块茎、叶经过Western blotting 检测和ImageJ软件灰度定量剖析，建澤泻块茎中AoSS蛋白表达量高于叶（图5B）。endprint

4 討论

鲨烯合酶为三萜生物组成途径中的要害酶，竞赛运用 FPP 组成三萜，其含量和活性决议了下流产品的含量，SS基因的过量表达可促进三萜类化合物组成^[17，22]。本研讨在前期克隆取得AoSS全长的根底上，展开建泽泻鲨烯合酶原核表达、功用验证及其免疫检测研讨，为进一步展开AoSS基因功用及其调控机制研讨奠定根底。

构建原核表达载体，将意图蛋白在大肠杆菌内高效表达。但由于原核生物缺少蛋白质翻译后加工润饰的进程，使蛋白无法折叠或构成正确的二硫键，常以包容体的办法存在于细胞中^[23]。包容体因立体结构存在过错，没有生物活性，包容体的复性是获取有活性蛋白的要害步骤，包容体的复性条件对其构象和活性有着重要的影响^[24]。因而，本研讨将充沛洗刷的包容体溶解于8 mol·L-1的尿素，逐渐成倍梯度稀释下降尿素浓度，有助于削减蛋白复性进程中发生的沉积，保证包容体可以构成正确的二硫键，进行特定空间结构的折叠，终究取得可溶性且具有生物活性的AoSS蛋白。AoSS意图蛋白的取得为其功用判定供给底物，一起也为多克隆抗体的制备供给资料根底。

体外表达蛋白催化活性剖析是基因功用研讨的重要手法^[25]，本研讨对得到的蛋白，选用体外酶促反响验证其功用，GC-MS成果显现该蛋白具有催化FPP生成鲨烯的活性。本研讨初次证明了建泽泻鲨烯合酶基因的功用，为提醒泽泻三萜构成的分子机制奠定了理论根底，为全面解析三萜生物组成的机制供给根据。

从翻译水平讨论泽泻原萜烷型三萜类化合物与AoSS表达的联系，免疫学技能是研讨蛋白质表达水平的有用办法，因其快速、简洁、特异性高、不依赖酶活性、易于符号等特色，得到较为广泛的运用^[26]。本研讨运用纯化的AoSS蛋白免疫新西兰兔，制备取得多克隆抗体，ELISA及Western blotting 成果显现其抗体具有较高的效价及杰出的特异性，树立快速免疫检测办法，对建泽泻不同安排中的AoSS蛋白表达进行剖析，成果显现其在块茎中表达量最高，其次是叶，根中表达甚微。泽泻块茎不仅是原萜烷型三萜成分构成的首要器官，也是储藏器官^[11]，较高的表达量可能与原萜烷型三萜组成部位有关，估测泽泻原萜烷型三萜生物组成的首要器官为块茎。本研讨为泽泻原萜烷型三萜生物组成途径说明及其调控机制研讨奠定根底，为该类资源性成分的组成生物学运用供给科学根据。

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[責任修改 吕冬梅]endprint