化疗一次大约多少钱：沙利度胺对前列腺癌PC3细胞的增殖及其IL—6和Cx43表达的影响

尹卫华+夏红梅+罗小瑾+徐荣+胡小雄

[摘要]意图 调查沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的效果及其IL-6和Cx43表达的影响。办法 将递加浓度6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺参加处于对数成长时间的前列腺癌PC3细胞培育。选用MTT法检测不同浓度沙利度胺对PC3细胞的增殖按捺影响，Annexin PI双染色法检测PC3细胞凋亡状况，ELISA法检测PC3细胞中IL-6和Cx43的表达。成果 25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺能显着按捺PC3细胞体外增殖，跟着时刻延伸、浓度添加，增殖按捺率相应升高；IL-6表达随沙利度胺浓度添加而下降（r=-0.924，P=0.009），Cx43表达与沙利度胺浓度成正相关（r=0.915，P=0.010）。定论 沙利度胺可经过按捺人前列腺癌PC3细胞IL-6表达、上调Cx43水平，可能康复细胞缝隙衔接通讯功用来按捺肿瘤细胞增殖、诱导其调亡，然后到达抗肿瘤效果。

[关键词]沙利度胺；前列腺癌；白介素-6；衔接蛋白43

[中图分类号] R737.25 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（b）-0008-04

[Abstract]Objective To observe the effects of Thalidomide on the proliferation and apoptosis of prostate cancer PC3 cells，as well as on the expression of the protein Cx43 and IL-6 in this cells.Methods Thalidomide with different concentrations （6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μg/ml） was added to PC3 cells at the logarithmic growth phase.MTT was used to detect the inhibitory effect of different concentration of Thalidomide on proliferation of PC3 cells，the apoptosis rate of PC3 cells was studied by Annexin V fluorescein isothiocyanate （Annexin PI） double staining with flow cytometry.Enzyme-linked Immunosorbnent assay method was used to detect the expression of IL-6 and Cx43 in PC3 cells.Results Below 25.00，50.00，100.00 μg/ml，Talidomide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells in vitro，and the inhibition rate increased with the increase of time and concentration，the expression of IL-6 decreased with the increasing of concentration（r=-0.924，P=0.009），the expression of Cx43 had positive correlation with the concentration of thalidomide（r=0.915，P=0.010）.Conclusion Thalidomide can inhibit the expression of IL-6 in PC3 cells，increase the expression levels of Cx43，restore the functional refreshment of gap junction intercellular communication function in prostate cancer PC3 cells for in inhibiting the proliferation of PC3 cells and inducing its apoptosis，in order to inhibit the growth of tumor.

[Key words]Thalidomide；Prostate cancer；Interleulin-6；Connexin43

前列腺癌是现在男性最常見的泌尿体系恶性肿瘤之一，在西方国家，其逝世率位居恶性肿瘤的第2位[1-2]。近年来，我国前列腺癌发病率显着呈上升趋势[3-4]。前期前列腺癌选用去势医治取得了必定的效果，18～24个月发展为激素非依靠性前列腺癌。现在激素非依靠性前列腺癌缺少有用的医治手法，是前列腺癌患者逝世的首要原因。尽管以紫杉醇类为根底的化疗药如多西他赛、卡巴他赛以及新药阿比特龙，Sipuleucel-T疫苗可改进激素非依靠性前列腺癌患者短期生计，但仍然逃脱不了耐药、免疫耐受的问题[5-6]。相关研讨显现，前列腺癌发展可能与白介素-6（interleulin-6，IL-6）、衔接蛋白43（Connexin43，Cx43）有关[7-11]。IL-6是具有激烈激起雄激素受体，上调肿瘤细胞VEGF的表达，是前列腺癌发展要素之一[7-8]。Cx43是介导细胞间缝隙衔接通讯（gap junctional intercellular communation，GJIC）的蛋白，为肿瘤细胞和血管内皮细胞供给衔接途径，GJIC功用受Cx43的调控；Cx43表达下降，GJIC搬运功用低可促进肿瘤细胞的成长和正常细胞的恶性表型转化，在激素非依靠性前列腺癌的细胞生物学行为恶化进程中起决定效果[9-11]。

沙利度胺又叫反响停，是一种合成性的谷氨酸衍生物，化学名称是N-（2，6-二氧代-3哌啶基）-邻苯二甲酰亚胺，经过按捺血管增殖、调理机体免疫，然后按捺肿瘤成长，详细机制不清楚。本课题组前期工作提示，沙利度胺能按捺IL-6，上调Cx43，本试验旨在运用体外细胞培育来调查沙利度胺对前列腺癌PC3细胞增殖及其IL-6、Cx43表达的影响，从细胞通讯的视点来评论激素非依靠性前列腺癌分子机制。

1材料与办法

1.1材料

人雄激素非依靠型前列腺癌PC3细胞株由南边医科大学生物技术学院赠送。纯品沙利度胺购自常州制药厂。DMEM培育基、胎牛血清均购于美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液（100X）购自我国碧云天生物技术公司；IL-6、CX ELISA试剂盒、Annexin试剂盒均置办R&D Systems总公司；流式细胞仪：美国BD公司FACS Vantage产品，运用CellQuest软件体系进行剖析。

1.2办法

1.2.1细胞培育及增殖试验检测 前列腺癌PC3细胞置于含10%胎牛血清DMEM培育基，37℃ 5%二氧化碳连续培育，取成长状况杰出的PC3细胞，经0.25%胰酶消化，参加96孔板，以5×105个/孔接种到96孔培育板，每孔200 μl。试验分为空白对照组、沙利度胺试验组，试验组均设6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml共5个浓度，每个浓度设5个复孔。细胞呈对数成长时间时加药，持续培育48 h后，每孔参加150 μl的MTT试剂（5 g/L），培育4 h，然后弃上清液，参加100 μl二甲基亚砜，震动15 min。用酶标仪测定492 nm波利益（以630 nm为参阅）的各孔吸光度D（λ）值，核算PC3细胞增殖按捺率。细胞增殖按捺率=（1-试验组D492 nm/空白对照组D492 nm）×100%。

1.2.2细胞调亡试验 按上述试验，离心搜集各处理组的细胞，按凋亡检测试剂说明进程行Annexin V与碘化丙啶（propidium iodide，PI）双标染色，上流式细胞仪进行检测。

1.2.3 IL-6和Cx43检测 PC3细胞在培育24、48 h后，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清液。按ELISA操作说明书检测Cx43和IL-6蛋白的表达。

1.3统计学办法

选用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）表明，选用t查验和方差剖析，计数材料用百分率（%）表明，选用χ2查验，相关性剖析选用Spearman等级相关剖析，以P<0.05為差异有统计学含义。

2成果

2.1沙利度胺对PC3细胞增殖的影响

MTT法成果显现，细胞增殖均出现不同程度的按捺，且随沙利度胺浓度添加、效果时刻延伸，沙利度胺对PC3细胞的增殖按捺效果逐步增强，呈显着的剂量-效应和时刻-效应依靠联系。不同浓度沙利度胺效果PC3细胞24、48 h后，按捺率由1.3%增至48.6%（图1）。

2.2沙利度胺对PC3细胞凋亡的影响

不同浓度沙利度胺效果PC3细胞48 h后，25.00、50.00、100.00 μg/ml组凋亡率分别为（8.02±0.15）、（15.70±0.23）、（48.10±0.33），空白对照组细胞的凋亡率为（0.01±0.01），不同浓度的沙利度胺组与空白对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05）（图2）。

2.3不同浓度沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43表达水平的影响

随沙利度胺效果时刻的延伸，各试验组Cx43表达均逐步升高，沙利度胺药物效果浓度最高100.00 μg/ml组表达最早且最显着，而沙利度胺药物浓度最低6.25 μg/ml组表达最不显着。IL-6随沙利度胺浓度、效果时刻的延伸，表达均逐步下降，沙利度胺药物效果浓度最高的100.00 μg/ml组表达下降最显着，而沙利度胺药物浓度最低的6.25 μg/ml组表达最不显着。24 h后，100.00 μg/ml组Cx43、IL-6与其他组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；48 h后，25.00 μg/ml组、50.00 μg/ml组、100.00 μg/ml组优于空白对照组（P<0.05）。PC3细胞Cx43表达量与沙利度胺的浓度成正相关（r=0.915，P=0.010），而IL-6表达与沙利度胺浓度成负相关（r=-0.924，P=0.009）（图3）。

3评论

激素非依靠性前列腺癌发展是多种要素、多进程导致肿瘤微环境反常[12]，然后引起癌细胞以更恶性的生物行为复发，或取得雄激素非依靠性增殖才能，给临床上医治带来窘境。人Cx43首要经过构成细胞膜间的通道样结构，为肿瘤细胞和血管内皮细胞供给衔接途径；Cx43经过细GJIC间接调控肿瘤细胞的成长和正常细胞的恶性表型转化，在前列腺癌发展进程中起必定的效果。研讨显现，Cx43为前列腺基底细胞衔接通讯点，其介导的GJIC对保持前列腺安排中的细胞稳态、调控细胞成长和分解起关键效果，GJIC功用反常可能会导致细胞的恶性转化；Cx43蛋白在前列腺癌安排中表达及其强度下降，且与前列腺癌恶性程度成负相关，说明癌细胞的GJIC水平遍及下降，导致了上皮细胞反常或不能操控其成长增殖和分解，进而促进了恶性表型的发展[9-11]。此外，IL-6作为炎性因子，参加调控包含前列腺癌在内的多种肿瘤的血管构成、肿瘤发作及搬运进程，其机制多与JAK或Stat3信号通路有关。在LNCap细胞中，IL-6经过Stat3途径激活雄激素受体（androgen receptor，AR），上调VEGF表达，然后发动AR介导的基因表达。进一步研讨证明LNCap细胞过表达IL-6，可添加前列腺特异性抗原mRNA的表达水平，下降LNCap细胞因雄激素阻断引起的凋亡[13-15]。一起，可诱导癌细胞的上皮细胞-间充质转化发作，与细胞间通讯功用有必定的联系[16-17]，现在机制不清楚。Cx43和IL-6均效果于肿瘤血管内皮细胞，可能使Cx43的羧基端S325与酪蛋白激酶1结合后磷酸化，影响VEGF和IL-6的表达。

沙利度胺作为抗肿瘤血管生成剂之一，能按捺相关血管生成因子如VEGF、bFGF的效果[18]，依据本课题组前期临床经验，在肺癌放化疗使用中具有杰出的效果[19]。本研讨提示，沙利度胺效果于PC3细胞48 h后，凋亡率显着高于对照组（P<0.05），诱导细胞凋亡可能是其按捺PC3细胞增殖的机制之一；一起发现，跟着沙利度胺浓度的添加，Cx43的表达增强，与肿瘤增殖显着成负相关；而IL-6的表达量削减，肿瘤增殖也削减。进一步说明沙利度胺效果前列腺癌的机制，经过上调Cx43和按捺IL-6表达，康复PC3细胞GJIC的功用来按捺前列腺癌成长。

在长时间使用沙利度胺医治肺癌的病例中，本课题组发现沙利度胺能够按捺IL-6的表达，但其最常见不良反响为心律失常，首要表现为房室传导阻滞和心动过缓[19]。Cx43散布于心房和心室[20]；沙利度胺在肿瘤医治进程中，可能导致心肌Cx43的细胞缝隙衔接的数量并使功用出现反常，引起心律失常，从这一个旁边面印证了沙利度胺对Cx43的效果。这提示沙利度胺对IL-6和Cx43效果机制比较复杂，可能经过多条信号通路完结。本试验开始研讨沙利度胺对PC3细胞中IL-6和Cx43的表达发生必定的影响，关于其效果机制有待于进一步研讨。

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（收稿日期：2016-12-28 本文修改：方菊花）

[作者简介]尹卫华（1976-），博士，副主任医师，首要从事肿瘤免疫研讨

通讯作者：罗小瑾（1981-），硕士，副主任医师，首要从事泌尿外科疾病研讨