丙泊酚芬太尼 芬太尼联合丙泊酚对大鼠肺缺血再灌注损害的维护效果

温文++++++郭光伟++++++黄志刚++++++孙国栋++++++李晓辉

[摘要] 意图 评论芬太尼联合丙泊酚效果于大鼠肺缺血再灌注损害(I／R)模型后，对核因子-κB（nuclear factor-κB）表达的影响及其机制。办法 将40只雄性Wistar大鼠随机分为5组（n=8）：假手术组（S组）、缺血再灌注损害组（I/R组）、芬太尼干涉组（F 组）,丙泊酚干涉组（P 组），芬太尼联合丙泊酚干涉组（F+P组）。对大鼠动脉血进行血气剖析；检测大鼠肺安排湿/干（W/D）值；对大鼠肺安排进行大体形状学及HE染色后镜下病理学调查，选用免疫组化法测定大鼠肺安排NF-κB表达水平的改动。 成果 与I/R组比较，F组、P组以及F+P组大鼠肺安排核因子-κB表达显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）；大鼠动脉血PaO2值升高，差异有统计学含义（P＜0.01）；大鼠肺安排W/D值显着下降，差异有统计学含义（P＜0.01）。I/R组肺毛细血管扩张充血，肺泡间质水肿并有炎性细胞滋润，肺泡腔内可见炎性细胞渗出。假手术组（S组）、芬太尼干涉组(F 组),丙泊酚干涉组（P 组），芬太尼联合丙泊酚干涉组(F+P组)在肺泡结构较完整性，减轻肺间质及肺泡腔渗出、水肿肺安排维护方面均较I/R组显着减轻。 定论 芬太尼联合丙泊酚干涉可显着减轻大鼠肺缺血再灌注损害，或许是芬太尼联合丙泊酚能下降大鼠肺安排NF-κB水平有关。

[关键词] 芬太尼；丙泊酚；核因子-κB；缺血再灌注损害

[中图分类号] R614[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2014）15-0010-04

Protective effects of fentanyl combined with propofol on pulmonary ischemia reperfusion injury in rats

WEN Wen GUO Guangwei HUANG Zhigang SUN Guodong LI Xiaohui

Department of Cardiothoracic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To study the expression of nuclear factor-κB(NF-κB) in the lung and plasma separately and explore the possible mechanisms of fentanyl combine with propofol on lung ischemia-reperfusion injury of rats. Methods The 40 Wistar male rats weighing 220 ～ 270 g were divided randomly into five groups which were pretreated differently. The values of NF-κB in rats lung was detected by using immunohistochemical method, the lung tissue observed in vitro and under the microscope after HE staining， the rats arterial oxygen pressure and the lung tissue W / D ratio were measured in each group. Results Compared with the I / R group, the F group, the P group, and the F+P group all followed the same trend: the NF-κB expression levels were obviously lower (P＜0.01), the values of PaO2 were obviously higher(P＜0.01), and the W / D ratios were lower(P＜0.01). Conclusion Fentanyl combined with propofol can significantly reduce lung ischemia-reperfusion injury, it may be that fentanyl combined with propofol can reduce the level of NF-κB in rats lung.

[Key words] Fentanyl; Propofol ; Nuclear factor-κB ; Ischemia reperfusion injury缺血再灌注常发生在安排器官缺血后康复血供，如休克时微循环的疏通、冠状动脉痉挛的缓解、溶栓疗法等血管再通术后、心脏骤停后心脑肺复苏、 PTCA、动脉搭桥术、心脏外科体外循环术、器官移植及断肢再植等，对心、脑、肠、肝的缺血再灌注损害的研讨较多，而肺缺血再灌注损害相对较少。有报导称，NF-κB 的激活能调理多种炎性因子基因的表达，与免疫反响有关[1]。跟着对芬太尼及丙泊酚研讨的深化发现，芬太尼及丙泊酚可按捺NF-κB的过度发生，然后起到减轻安排器官缺血/再灌注损害的效果。但是现在关于芬太尼以及丙泊酚二者独自运用对急性肺缺血再灌注损害的维护效果怎么以及联合应用在急性肺缺血再灌注损害中是否优于单纯运用芬太尼或丙泊酚尚不清楚。本文经过检测肺安排中NF-κB表达水平，及芬太尼联合丙泊酚对NF-κB表达水平的影响，旨在评论芬太尼及丙泊酚在肺缺血再灌注损害中对肺安排维护的效果机制。

1资料与办法

1.1首要试剂

丙泊酚打针液（北京费森尤斯卡比医药有限公司），芬太尼打针液（宜昌人福药业有限公司），兔 NF-κBp65抗体（武汉博士德生物工程有限公司），SA1022-兔IgG型SABC免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2试验分组与模型缔造

1.2.1 分组 8周龄健康雄性Wistar大鼠40只，体重220～270 g，随机分为5组，每组8只。

1.2.2 造模 改进的Eppinger法缔造在体大鼠肺缺血再灌注引起的急性肺损害模型。25%乌拉坦按4 mL/kg腹腔打针麻醉，颈部游离右颈动脉及气管后气管插管，接呼吸机，通气频率为75次/min，潮气量为10 mL，吸呼比为1∶2，机械通气10min待动物状况安稳后，左边第5肋间进胸，创面止血完全后固定开胸器，用无创血管夹夹闭左肺门。夹闭肺门前，应细心游离左肺门并将左下肺韧带离断，尾缘静脉打针50 U肝素 5min。关胸30 min后敞开血管夹行缺血后复流60min。缺血再灌注组(I/R组)仅阻断左肺门30 min；芬太尼医治组（F组）阻断左肺门前给予20 μg/kg芬太尼，之后阻断30min；丙泊酚医治组（P组）阻断左肺门前给予50mg/kg丙泊酚，之后阻断肺门30 min；芬太尼联合丙泊酚组（F+P组），给予20 μg/kg芬太尼以及50mg/kg丙泊酚后阻断左肺门30 min。前四组阻断肺门并履行相关操作后关胸。假手术组（S组）仅敞开胸腔一段时刻（与其他四组时刻相同）。再灌注结束后，经颈动脉取血0.5 mL进行动脉血气剖析，颈椎脱臼处死大鼠后取左肺下叶进行肺湿/干（wet/dry，W/D）值检测，取左肺上叶白腊包埋并切片，每只大鼠切片两张，别离进行苏木精-伊红（HE）染色病理学调查以及免疫组化检测。

1.3 检测目标

1.3.1肺安排湿/干（wet/dry，W/D）值的核算测定并记载处身后大鼠的左肺下半叶肺安排湿重（W），置于60℃恒温烘箱中烘烤 48 h至恒重，测定并记载干重（D），求得二者比值即为湿/干重（W/D）值。

1.3.2动脉血气剖析各组大鼠处死前经颈动脉取动脉血0.5 mL，测定PaO2 值。经过PaO2值改动反响肺气体交流状况，进一步判别肺缺血再灌注损害状况，是反响肺功用的重要目标。

1.3.3肺安排病理形状调查大鼠左肺上叶HE染色，取大鼠左肺上叶放入4% 甲醛中固定、白腊包埋、每只大鼠切片两张，别离进行HE染色病理学剖析及免疫组化检测。将肺安排HE染色后，光镜下调查肺安排的病理形状学改动。

1.3.4肺安排中核因子-κB表达水平的检测免疫组化 SABC法测定大鼠左上叶肺安排 NF-κB表达水平的改动。按说明书操作，取白腊片按程序脱蜡至水，灭活内源性酶、热抗原修正、BSA 关闭、滴加的一抗阴性对照以PBS为一抗、滴加二抗（1∶100稀释生物素化山羊抗兔 IgG）、滴加 SABC后，加 DAB试剂盒（AR1022试剂盒中 A、B、C 试剂各 1 滴），室温显色。苏木素复染，脱水、通明、枯燥、树脂封片。以胞浆及胞核呈现棕黄色颗粒为阳性规范，镜下扩大 400倍，随机选取不堆叠的10个视界，运用图画剖析体系核算出每个视界阳性细胞数占总细胞数的百分比并取平均值。

1.4统计学处理

一切数据选用SPSS17.0统计学剖析软件进行处理，测定成果用均数±规范差（x±s）表明，均数之间比较选用单要素方差剖析，组间两两比较选用LSD-t办法查验，P<0.05为差异具有统计学含义。

2成果

2.1大鼠肺安排湿/干质量（wet/dry mass，W/D）值的核算

I/R组水肿较显着，与I/R组比较，S组、F组、P组和F+P组的W/D值显着下降，差异有统计学含义 （P<0.01）；单药组F组与P组W/D值比较无显着差异 （P>0.05）；联合用药组F+P组与单药组F组或P组别离比较W/D值显着下降，差异有统计学含义 （P<0.01）,见表1。

2.2各组大鼠PaO2的改动状况

I/R组PaO2值显着下降，与I/R组比较，S组、F组、P组和 F+P组的PaO2值显着升高，差异有统计学含义（P<0.01）；F组与P组PaO2值比较无显着差异（P>0.05）；F组或P组与F+P组别离比较，PaO2值显着下降，差异有统计学含义（P<0.01），见表1。

2.3大鼠肺安排病理学调查

S组大鼠肺安排病理学改动不显着；与S组构成比照，I/R组大鼠肺安排间质毛细血管呈现淤血、扩张现象，肺泡壁增厚，肺间质水肿，肺间质及肺泡内很多的红细胞和液体以及中性粒细胞滋润渗出，呈现出严峻病理改动；F组和P组大鼠肺间质及肺泡渗出、炎性细胞滋润程度较I/R组轻。联合用药组F+P组大鼠肺安排改动较单药组状况更好。

2.4 NF-κB在肺安排免疫组化处理之后表达散布以及表达水平

S组（图1）可见浅棕黄色染色弱阴性颗粒，极少量散布于炎性细胞及肺泡上皮的胞浆中，胞核中极罕见阳性表达；I/R组（图2）不只很多炎性细胞、肺泡上皮细胞的胞浆中散布有较强棕黄色染色颗粒，细胞核中也呈现了较强棕黄色颗粒；F组（图3）和P组（ 图4）炎性细胞以及肺泡上皮细胞的胞浆及胞核中较多的散布有棕黄色染色颗粒；F+P组（图5）棕黄色染色颗粒较F组及P组少的散布于炎性细胞以及肺泡上皮细胞的胞浆之中。

图1 S组再灌注60 min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒散布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量很少

图2 I/R组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒散布于细胞浆，NF-κB很多表达

图3 F组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 染色颗粒散布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量削减

图4 P组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 棕黄色染色颗粒散布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量削减

图5 P+F组再灌注60min NF-κB免疫组化染色（×100） 棕黄色染色颗粒散布于细胞浆，与I/R组比较NF-κB的表达量显着削减

肺缺血再灌注后，与I/R组比较，S组、F组、P组以及F+P组NF-κB表达水平显着下降 ，差异有统计学含义（P<0.01）；F组与P组比较，NF-κB表达水平无显着差异（P>0.05）；F+P组与F组、P组别离进行比较，NF-κB表达水平显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）,见表1。

表1 各组别肺安排W/D值、Pa02值（mmHg）、NF-κB改动

（x±s，n=8,％）

注：I/R组W/D值、PaO2值、NF-κB改动与其他各组比较差异有统计学含义（P＜0.01）; F组与P组比较差异无统计学含义（P＞0.05）

3 评论

核因子-κB（NF-κB）是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的、从免疫B细胞中发现的转录调理因子，具有广泛的生物学活性，活化后可以参加许多基因表达的调控，在基因水平对多种炎症因子的激活发挥着重要效果。典型的NF-κB是由p65和p50单体构成的异源性二聚体。 NF-κB含有一段担任与DNA结合、二聚体化和核转位，一起也是按捺蛋白IκB（inhibitor of NF-kappa B）的结合位点的区域，由300个氨基酸构成，称为Rel同源区。在未受到胞外要素影响时， NF-κB与IκB结合并以结合型NF-κB的非活性异寡聚体的状况存在于细胞核外。安排细胞外多种损害要素，如IL-1、TNF-α、氧自由基、内毒素、病毒蛋白、生长因子以及缺血再灌注损害、气压伤、严峻伤口等要素的影响可经过信号传导引起IκB降解，然后导致NF-κB-IκB复合物崩溃，活化的NF-κB进入核内，并与DNA链上特定的κB序列特异性结合，发动和调理众多与免疫和炎症反响有关的基因转录[2]，加快有关基因编码的趋化因子、黏附分子、转录因子、炎症相关的凋亡按捺因子以及酶和按捺剂等的表达[3]。NF-κB经过调理多种细胞因子转录，对细胞因子之间发生广泛效果[4]，然后导致细胞发生一系列正反馈级联扩大的炎症损害反响,然后导致肺缺血再灌注损害[5]。因而，检测大鼠肺安排中NF-κB的表达水平，或许反映肺损害炎症反响强弱程度以及点评药物运用干涉的医治效果。

芬太尼作为阿片受体激动剂，效果于边缘体系与心情有关的阿片类受体，有消除严重和焦虑的效果。因为具有镇痛效价高、下降心肌氧耗及无组胺开释的优势，现在已广泛应用于手术前诱导、术中保持以及术后的冷静与镇痛，已根本替代吗啡。近来发现芬太尼预处理缺血再灌注器官对NF-κB表达能有下降的效果。芬太尼是一种与吗啡结构相似的同类镇痛药，结合吗啡对NF-κB的免疫调理效应经过阿片类受体完成[6]，引起与缺血预适应相似的效果[7]，因而揣度芬太尼也或许经过影响NF-κB的活性而发挥按捺缺血再灌注损害的效果。刘志恒[8]等经过运用芬太尼处理人T 淋巴瘤细胞系Jurkat 细胞，检测出Jurkat 细胞中NF-κB的表达有所下降。