特立帕肽 特立帕肽对晚年去卵巢大鼠血管钙化的影响
陈斌花+陈秋霞+姜醒华
[摘要] 意图 查询特立帕肽对晚年去卵巢大鼠血管钙化的影响，并评论其发挥效果的分子机制。 办法 用30只10个月龄SD大鼠，随机分为3组：假手术组、去卵巢组及特立帕肽医治组。特立帕肽医治组给予20 μg/kg特立帕肽皮下打针，隔天1次，继续12周。术前及给药期间搜集大鼠血清，给药完毕后查询子宫的安排学改动。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血中未羧化基质羧基谷氨酸蛋白（uc-MGP）的量及雌激素的改动；原子分光光度计丈量血管总钙含量；Von Kossa染色查询动脉钙化；免疫组化法查询血管uc-MGP的表达；荧光实时定量PCR扩增MGP mRNA，查询其在胸主动脉的表达水平。 成果 血清中uc-MGP含量去卵巢组最高，特立帕肽医治组其次，假手术组最低（P<0.05）。去卵巢组及特立帕肽医治组雌激素水平显着下降（P<0.05）。去卵巢组血管总钙含量显着高于假手术组（P<0.01），特立帕肽医治组显着低于去卵巢组（P<0.01）。血管未羧化MGP表达呈现在血管钙化周围区域，钙化严重组表达较多。特立帕肽医治组阳性较少表达。去卵巢组表达量最低，假手术组MGP mRNA表达量最高，特立帕肽医治组表达量介于两者之间，差异有计算学含义（P<0.01）。 定论 特立帕肽对绝经后血管钙化有改进效果，或许是经过调理MGP的基因表达及活性发挥效果。
[关键词] 特立帕肽；MGP；去卵巢大鼠；血管钙化
[中图分类号] R982 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）01（c）-0004-05
骨质疏松和血管钙化的发病率逐步升高，给社会和人类构成极大的损害。近期，Lampropoulos等[1]研讨标明，绝经后女人骨质疏松和血管钙化可一起呈现，且具有相关性。血管钙化是高度可调控、与骨质构成类似的细胞生物学进程，血管钙化和骨质疏松的发病在流行病学、分子生物学、细胞生物学、遗传学和印象学研讨均标明具有一起的机制[2]。
近年来，对骨质疏松症的医治有了显着的发展，临床所用的药物首要是抗骨吸收，而甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是仅有影响骨构成的医治药物。PTH是由84个氨基酸残基组成的一条直链多肽分子，在骨稳态的调理进程中发挥重要效果，具有促骨吸收和促骨构成的效果，生物效应依赖于PTH的效果方式，小剂量连续运用促进骨构成，继续运用则引起骨丢掉。2002年11月重组人甲状腺激素rPTH（1-34）产品特立帕肽（teriparatide，Forteo）获美国FDA同意用于医治骨质疏松症。有研讨显现，特立帕肽能够改进高糖诱导大血管的血管钙化[3]，而特立帕肽对女人绝经后骨质疏松一起高发血管钙化的影响没有见报导，本研讨评论特立帕肽对晚年去卵巢大鼠血管钙化的影响及开始机制。
1 材料与办法
1.1 材料
10个月龄Sprague-Dawly（SD）雌性大鼠（购自南京大学方式动物研讨所）；特立帕肽打针液（购自上海市嘉瑞医药有限公司）；大鼠未羧化基质γ羧基谷氨酸蛋白（uc-MGP）定量检测试剂盒（购自北京方程生物科技有限公司）；基质γ羧基谷氨酸蛋白（未羧化）一抗（Abcam）；超敏二步法免疫组化检测试剂盒（北京中山金桥生物有限公司）；酶标仪（北京普天新桥技能有限公司）；原子分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；PRISM 7500 PCR仪（美国ABI公司）；Prime Script RT reagent Kit（Perfect Real Time）（DRR037S）、Premix Ex Taq（Perfect Real Time）（DRR039A）、PCR配套试剂（购自上海机康生物技能有限公司）；其他试剂均为市售剖析纯。
1.2 试验分组及动物模型构建
30只SD雌性大鼠适应性喂食2周后，随机分为假手术组（n=10）与模型组（n=20），大鼠用戊巴比妥钠溶液（浓度3%，按0.1 ml/100 g计量）腹腔打针麻醉，俯卧位，切除卵巢。假手术组仅切除卵巢周约卵巢巨细的部分脂肪。手术1周后将模型组随机分为去卵巢组（单纯去卵巢）和特立帕肽医治组（去卵巢后特立帕肽干涉医治）。
1.3 药物干涉及标本搜集
特立帕肽医治组给予20 μg/kg皮下打针，隔天1次，继续12周。术前及术后隔两周眼眶静脉丛取血，共搜集5次。试验动物于13周末麻醉后开腹取胸腹主动脉全长，主动脉弓下约2 cm于-80℃冰箱保存，再向下截取1 cm保存于4%多聚甲醛固定液中。
1.4 ELISA测定血清中uc-MGP含量及雌激素水平
5次血清uc-MGP含量及手术前和试验完毕时血中雌激素水平依照试剂盒阐明书进行，在酶标仪（波长450 nm）测定样本吸光度，依据规范曲线核算各样本中uc-MGP及雌激素的含量，一切标本会集检测。
1.5 血管总钙含量测定[4]
胸主动脉（约1 cm）80℃烤干，称重，参加2 mol/L硝酸3 ml，18℃消化并烤干，冷却后参加去离子水（含27 nmol/L的氯化钾和27 μmol/L的氯化镧）10 ml复溶，取2 ml参加1%氯化锶100 μl，原子吸收分光光度计测吸光度（波长422.7 nm），测定安排的钙含量[nmol/（mg·pr）]。
1.6 血管Von Kossa染色[4]
血管安排进行白腊包埋、切片，行惯例脱腊、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，日光照耀60 min，再用3%的硫代硫酸钠溶液处理5 min定影，碱性品红复染、脱水、通明、封片。
1.7 免疫组化检测uc-MGP的表达量
取上述白腊切片脱蜡脱水，抗原修正后，滴加正常兔血清封闭液，室温孵育30 min；滴加兔抗大鼠uc-MGP多克隆抗体（1∶400），4℃过夜；滴加二抗，37℃孵育1 h；滴加DAB显色液；苏木素复染，1%盐酸酒精分解，稀氨水返蓝，梯度酒精脱水枯燥封片，镜下查询。
1.8 Taq Man探针法荧光定量PCR检测大鼠血管中MGP mRNA的转录水平
按Trizol RNA提取试剂盒阐明书进程提取安排总RAN，用核酸剖析仪测定RNA浓度和纯度，OD260/280为1.8～2.0。当即反转录组成cDNA：取2 μl RNA样本，反响体系20 μl，反响条件：37℃ 15 min，85℃ 5s，1个循环。取2 μl cDNA模板进行意图基因MGP和内参基因GAPDH的PCR扩增。引物及探针均由上海机康生物技能有限公司规划组成。MGP引物序列：上游引物3′-GCATCTAGTCCCGCATCGC-5′，下流引物3′-CAATGCCTCAGACCAAAGTATAAGG-5′，探针序列：3′-（Eclipse）GACTTCATCGCCAACATCCGCCGCA-5′（FAM）；GAPDH序列：上游引物 3′-TCAGTATGACCTTGTACATCTGGT-5′，下流引物3′-CTCTAGGGCGATTGTAGTTTACC-5′。探针序列：3′-（Eclipse）TGA-CACGGCAACTTGAACGGCACC-5′（FAM）。PCR反响体系：Premix Ex TaqTM（1×）25 μl，MGP上下流引物（10 μmol/L）各1.0 μl，荧光探针溶液2.0 μl，ROX Reference Dye（50×）1.0 μl，DNA模板2.0 μl，灭菌蒸馏水16.0 μl，总反响体系为50.0 μl；内参基因GAPDH优化后的反响体系：Premix Ex TaqTM（1×）25 μl，GAPDH Forward Primer（10 μmol/L）0.8 μl，MGP Reverse Primer（10 μmol/L）0.8 μl，荧光探针溶液1.6 μl，ROX Reference Dye（50×）1.0 μl，DNA模板2.0 μl，灭菌蒸馏水18.0 μl，总反响体系为50.0 μl。反响条件均如下。预变性：95℃ 3 s，PCR：95℃ 5 s，60℃ 34 s，循环40次。每个标本检测3次。依据公式ΔΔCt=（CtMGP-CtGAPDH）试验组-（CtMGP-CtGAPDH）对照组，核算MGP的相对表达量。
1.9 计算学处理
选用SPSS 16.0计算软件处理数据，计量材料以x±s表明，不一起间各组比较选用重复丈量数据的两要素多水平方差剖析，多组比较选用单要素方差剖析，两两比较选用LSD法，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 去卵巢大鼠模型点评
2.1.1 子宫安排HE染色切片光镜下查询 卵巢切除13周后，假手术组显现大鼠子宫内膜上皮为单层柱状，固有层有丰厚的基质细胞和腺体，腺腔扩张，肌层玻璃样变不显着（图1A）；去卵巢组显现子宫内膜显着增生与鳞状化生，较厚，固有层基质细胞、腺体和血管显着削减，腺腔多闭合，肌层玻璃样变性（图1B）；特立帕肽医治组显现子宫内膜上皮摆放紊乱，固有层的基质细胞、腺体和血管削减，肌层玻璃样变轻，全体状况显着好于去卵巢组（图1C）。
2.1.2 各组大鼠术前和术后13周血中雌激素水平的比较 各组术前雌激素水平比较差异无计算学含义（P>0.05）；去卵巢组及特立帕肽医治组术后13周血中雌激素水平较术前及假手术组显着下降（P<0.05）（表1）。
2.2 各组大鼠血管总钙含量的比较
去卵巢组血管总钙含量显着高于假手术组（P<0.01）；特立帕肽医治组血管总钙含量较去卵巢组下降（P<0.01）（图2）。
2.3 各组大鼠主动脉Von Kossa染色状况
去卵巢组可见血管内里膜钙堆积（黑色颗粒，图3B）；特立帕肽医治组使内里膜堆积的钙显着削减（图3C）。
2.4 各组大鼠血清uc-MGP含量的改动
去卵巢组术后血清uc-MGP含量显着升高，特立帕肽医治组uc-MGP升高趋势不如去卵巢组显着（P<0.05），假手术组无显着改动（图4）。
2.5 各组大鼠主动脉uc-MGP免疫组化染色状况
各组血管壁均可见uc-MGP表达（棕黄色颗粒），去卵巢组表达uc-MGP显着较假手术组多，特立帕肽医治组较去卵巢组的表达量削减（图5、图6）。
2.6 各组大鼠血管MGP mRNA相对表达量的比较
MGP mRNA表达量最高的是假手术组，表达量最低的是去卵巢组，特立帕肽医治组表达量介于两者之间，差异有计算学含义（P<0.01）（表2）。
3 评论
血管钙化和骨质疏松是晚年人的常见病，特别多见于绝经后女人，并且常伴行呈现，给家庭和社会带来沉重的担负。作为仅有影响骨构成的骨质疏松医治药物——特立帕肽，具有添加骨密度、下降椎体骨折危险的切当效果，成为抗骨质疏松医治药物的新打破[5]。特立帕肽对绝经后女人高发血管钙化的影响尚不清晰，本研讨在老龄去卵巢大鼠模型上体系点评了特立帕肽对血管钙化的影响，并对其机制进行开始的评论，发现特立帕肽能够添加血管安排中MGP，使循环及安排中未羧化MGP的含量削减，进而影响血管钙化。
MGP最早从牛骨骼中分离出来，是一种维生素K依赖性蛋白，因其含有5个γ-羧基谷氨酸残基，活化需求γ-羧化效果，称为Gla蛋白[6]。它在骨、软骨及心、血管、肺等软安排中都有表达[7-8]。在血管中，血管平滑肌、巨噬细胞和内皮细胞都可组成MGP，是血管内异位钙化和软骨内骨构成的重要调理因子。维生素K使MGP谷氨酸残基羧化为有活性的γ-羧基谷氨酸基质蛋白，与羟基磷灰石亲和力增高，按捺钙堆积及羟基磷灰石晶体添加然后按捺血管钙化。假如MGP羧基化不完全，则以未羧化的MGP残基（uc-MGP）方式存在，其结合矿物质才能低下。很多研讨显现，循环uc-MGP和各种病理状况（如缓慢心力衰竭、肾衰竭、糖尿病风湿性疾病等）下的血管钙化成正相关，有望成为心血管事情新的生物标志物[9-11]。
本研讨证真实去卵巢模型中，特立帕肽干涉后血管安排中MGP添加，而血管及血液中未羧化MGP削减。以往关于PTH对MGP影响的研讨大多针对透析或糖尿病患者，而对绝经后女人PTH对MGP的影响鲜有报导。绝经后女人血管钙化和骨质疏松一起高发，在用特立帕肽医治骨质疏松的一起对血管钙化的影响不得不引起注重。
本研讨用12个月龄雌性去卵巢大鼠模仿晚年女人绝经后状况。雌性大鼠虽没有绝经期，但去卵巢后的身体状况与绝经后女人类似，是国际上最为常用的一种模仿妇女绝经后骨质疏松的模型[12]。试验成果中去卵巢后子宫HE染色形状改动及雌激素水平削减阐明建模成功。
本研讨显现，去卵巢组血管钙化添加和流行病学查询的绝经后女人血管钙化危险添加的报导相符。特立帕肽连续小剂量给药后，去卵巢大鼠的血管钙化显着改进。之前也有PTH削减血管钙化的报导，可是首要针对糖尿病患者[3]和肾衰竭患者[13]，而对女人绝经后血管钙化的影响没有见报导。为评论其机制，笔者检测了循环uc-MGP的含量和在血管中的散布及血管安排中MGP mRNA的改动。特立帕肽在改进血管钙化的一起，使循环及血管安排中uc-MGP的含量削减，血管MGP mRNA添加，阐明特立帕肽或许经过调理MGP的活化及转录调理去卵巢大鼠的血管钙化。Suttamanatwong等[14]在体外研讨显现，PTH能添加成骨细胞中MGP的表达，参加PTH诱导的骨矿化进程。PTH或许经过蛋白激酶A及其他信号通路调理成骨细胞内MGP的表达。有研讨显现，PTH经过改动Sp和Runx2转录因子的活性来调理成骨细胞内MGP的表达[15-18]。关于PTH对uc-MGP的影响没有见报导，但以上都阐明PTH和MGP之间存在密切联系。
综上所述，去卵巢大鼠血管钙化加剧，并伴有血管MGP mRNA表达削减，血管及血液中uc-MGP添加。特立帕肽干涉能够改进血管钙化，使血管MGP mRNA表达升高，血管及血液uc-MGP下降，阐明MGP在绝经后女人血管钙化的发病机制中有重要效果，而特立帕肽调理MGP基因的表达及活化效果或许是其按捺血管钙化效果机制之一。本试验只用了一种剂量和干涉时刻，不同剂量及干涉时刻或许会对MGP和血管钙化的影响不同，所以，特立帕肽按捺绝经后女人血管钙化，防治绝经后心血管疾病的适宜剂量、运用时刻及对其他体系的影响等有待进一步临床查询与研讨，详细的效果机制有待进一步评论。
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（收稿日期：2014-09-16 本文修改：李亚聪）