体总皂苷 蒸三七皂苷类活性组分在大鼠体内代谢产品判定的研讨
申文雯 张银 仇守蓓 朱粉霞 贾晓斌 汤道权 陈斌
[摘要]选用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时刻质谱仪联用技能（UPLCQTOFMS/MS）剖析大鼠灌胃蒸三七正丁醇部位后所得血液、尿液和粪便样品，获取正负离子形式下样品中化学成分的剖析数据。样品数据经PeakView软件处理后，依据原型化合物的结构特征以及体内常见代谢办法的精确质量数改变，对代谢产品进行解析。终究运用代谢物的MS/MS信息判定了蒸三七正丁醇部位中的4个皂苷代谢原型，即人参皂苷Rh4，Rk3，Rk1，Rg5及其15个代谢产品。蒸三七正丁醇部位中4个人参皂苷的代谢途径包含葡萄糖醛酸化、脱糖、硫酸化、脱羟甲基化、支链丢掉等。该文从定性视点对蒸三七首要活性皂苷类组分在体内的代谢打开了研讨，进一步说明蒸三七在体内发挥药效的物质基础。
[关键词]蒸三七正丁醇部位； 代谢产品判定； UPLCQTOFMS/MS； 人参皂苷Rh4，Rk3，Rk1，Rg5； 转化办法
[Abstract]UPLCQTOFMS/MS was used to identify metabolites in rat blood， urine and feces after the administration of nbutanol extract derived from steamed notoginseng The metabolic process of saponins came from steamed notoginseng was analyzed The metabolites were processed by PeakView software， and identified according to the structural characteristics of prototype compounds and the accurate qualitative and quantitative changes of common metabolic pathways Four saponins metabolites were identified based on MS/MS information of metabolites， namely ginsenoside Rh4， Rk3， Rk1， Rg5，and their 15 metabolites were verified The metabolic pathways of the four ginsenosides in nbutanol extract included glucuronidation， desugar， sulfation， dehydromethylation， and branch loss The metabolites of main active saponin components derived from steamed Panax notoginseng were analyzed from the perspective of qualitative analysis And the material basis for the efficacy of steamed notoginseng was further clarified.
[Key words]nbutanol extract derived from Panax notoginseng； identification of metabolites； UPLCQTOFMS/MS； ginsenoside Rh4， Rk3， Rk1， Rg5； transformation mode
三七為五加科植物三七Panax notoginseng （Burk.）F.H.Chen的枯燥根。蒸三七作为三七中的一种编造品，运用广泛，具有滋补血液、增强免疫功用、按捺肿瘤、增强健壮性、促进安排再生等成效，古人朴素知道为“熟补”。现代研讨标明，三七编造前后成分改变差异较大[1]。课题组前期研讨发现，蒸三七中含有很多的不同于生三七的皂苷类化合物，各皂苷成分是其发挥补血成效的真实物质基础[2]，药理实验标明以人参皂苷Rg3，Rg6，F4，Rh4，Rk3，Rk1，Rg5等为代表的皂苷类化合物具有增强免疫功用、按捺肿瘤等多种生物活性[37]。对蒸三七首要活性皂苷组分在体内进程的定性研讨，有利于提醒蒸三七首要活性部位在体内发挥药效的物质基础及效果机制。蒸三七首要皂苷部位的提取，选用经典皂苷提取办法，醇提后经正丁醇萃取。经文献查阅，有关生三七的总人参皂苷及各首要人参皂苷单体如人参皂苷Rg1，Rb1等的体内代谢产品判定研讨较多，而有关于蒸三七的相关内容没有报导。
本研讨经过搜集灌胃给予蒸三七正丁醇部位后的大鼠血浆样品、尿液和粪便样品，运用UPLCQTOFMS/MS联用技能，将QTOFMS/MS测定的精确质量用于判定蒸三七正丁醇部位在大鼠体内的代谢物，依据质谱裂解规则，估测代谢物的化学结构，总结代谢途径，为评论蒸三七的体内进程供给依据。
1资料
11仪器与试剂1260高效液相色谱仪（配有色谱泵，二级管阵列检测器，美国Agilent公司）；Waters AcquityTM UHPLC超高效液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）；MilliQ水纯化体系（美国Millipore公司）；Mettler Toledo剖析天平（瑞士Mettler Toledo剖析仪器有限公司）；AnkeTGL16G离心机（上海安亭科学仪器厂）。蒸三七正丁醇萃取部位（实验室克己）；人参皂苷Rk1对照品（成都曼斯特生物科技有限公司中国科学院成都生物研讨所，纯度>9504%）；人参皂苷Rk3，Rh4，Rg5对照品（上海永久生物科技有限公司，纯度>98%）；甲醇、乙腈（色谱级，德国Merck公司）；水为超纯水，其他试剂均为剖析纯。endprint
12动物SD大鼠，男女参半，体质量（250±20） g，由江苏省中医药研讨院动物中心供给，实验动物运用许可证号SYXK（苏）20162017。
2办法
21药材及样品的制备三七为五加科植物三七的枯燥根，来历于安徽亳州中药饮片厂，并经南京中医药大学黄一平研讨员判定。蒸三七的正丁醇部位的制备：取适量的蒸三七粉末，参加10倍量的70%乙醇，拌和均匀，于75 ℃水浴加热回流提取3次，再抽滤，兼并滤液，得粗提液，取所得粗提液，控温50 ℃于旋转蒸腾仪浓缩至浸膏状，再加少数水减压浓缩至原体积的1/5。提取液收回乙醇后，用适量水混悬，正丁醇萃取3次，兼并萃取液，挥去正丁醇，枯燥备用。
22动物分组及给药健康SD大鼠12只，按体质量随机分红2组，男女参半。实验开端前各组动物自在养殖1周，然后置代谢笼中自在养殖习惯3 d。实验选用单次灌胃给药办法，给药组大鼠按6 g·kg-1的剂量（相当于成人高剂量的40倍）给予制造好的蒸三七正丁醇部位1% CMCNa溶液；空白组给予等体积1% CMCNa灌胃。
23样品收集与处理血浆样品：于给药前和给药后05，1，2，4，6，8，12，24，36，48 h，由大鼠眼眶取血于预先涂有1%肝素钠生理盐水的EP管中，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，得到血浆样品。于-80 ℃条件下保存备用。剖析前将血浆样品于37 ℃冻结，冻结后精细汲取血浆200 μL，参加3倍量的甲醇600 μL，涡旋1 min，13 000 r·min-1离心5 min，取600 μL上清液于EP管中，4 ℃条件下氮气吹干，终究以甲醇150 μL复溶，涡旋30 s，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样检测。
别离收集给药前-12～0 h及给药后0～12，12～24 h的尿液和粪便样品，13 000 r·min-1离心10 min后，-80 ℃冷冻保存至上机检测。剖析前将尿液样品于37 ℃冻结，冻结后别离取大鼠各时刻段尿液2 mL，加3倍量甲醇，涡旋混匀3 min。13 000 r·min-1离心5 min后取上清液，氮气吹干，残渣加1 mL甲醇溶解，13 000 r·min-1离心10 min后取上清液，进样剖析。
将各时刻段大鼠粪便混合，烘箱50 ℃烘干备用。剖析前将粪便样品用研钵研碎，称取2 g，加10倍量甲醇浸泡并超声30 min，13 000 r·min-1离心10 min后取上清液，氮气吹干，残渣加2 mL甲醇溶解，13 000 r·min-1离心15 min后取上清液，进样剖析。
24色谱条件活动相A为01%甲酸水，B为乙腈溶液。样品的洗脱条件：0～25 min，20%～28% B；25～3 min，28%～36% B；3～55 min，36%～43% B；55～95 min，43%～50% B；95～10 min，50%～64% B；10～135 min，64%～100% B；135～145 min，100%～20% B。柱温40 ℃，流速04 mL·min-1，进样量2 μL。
25质谱条件选用TOF MSIDAMS/MS 形式，电喷雾离子源（ESI），选用正负离子形式扫描，掃描规模m/z 50～1 500。正负离子检测办法：气帘气（CUR）40 psi（1 psi=6895 kpa），雾化气（GS1）55 psi，辅佐气（GS2）55 psi，电喷雾电压（ISVF）4 500 eV，离子源温度（TEM）550 ℃，去簇电压（DP）±100 eV；TOF MS 形式下设置磕碰电压±10 eV，IDAMS/MS条件下设置磕碰电压±40 eV，磕碰电压差20 eV。
3成果
31人参皂苷原型成分的结构判定前期研讨已清晰蒸三七正丁醇部位中的首要成分为皂苷，因而本实验将蒸三七中各人参皂苷作为提取目标进行剖析。母体化合物及其代谢物在负形式下表现为其准分子离子[M-H]-或[M+HCOO]-，并经过MS和MS/MS碎裂行为和保存时刻来研讨断定其结构。依据或许的代谢途径及代谢产品的总结剖析，揣度出大都相关代谢物的结构。经过网络数据库或文献检索，如PubMed，SciFinder，CNKI等，运用Analyst TF 16软件的PeakView和Formulafinder等数据处理功用，经过峰提取和解析，并与对照品进行比对，在大鼠血浆、尿液及粪便中有4种个人参皂苷被开始判定出来，别离是人参皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5，其化学结构见图1。
人参皂苷Rk1 R1=glc（21）glc人参皂苷Rg5 R1=glc（21）glc
R2=HR2=H
人参皂苷Rk3 R1=H人参皂苷Rh4R1=H
R2=OglcR2=Oglc
3，Rh4，Rk1，Rg5
蒸三七中的首要有效成分各人参皂苷具有相同母核，即达玛烷型三萜，因而它们质谱信息很相似，在相同质谱条件下存在相似裂解规则，或许呈现相似的碎片离子。如m/z 504这个碎片离子均呈现在4种人参皂苷的首要碎片离子中，因各皂苷成分均脱去1分子葡萄糖所造成的。以人参皂苷Rg5的判定为例，其提取相对分子质量为766488 5，二级质谱供给的首要碎片离子m/z 613332 9，589333 8，571288 6，161049 6依据人参皂苷元素组成、相关裂解规则[910]和数据库在线比对，估测其分子式为C42H70O12，然后进一步揣度该成分为人参皂苷Rk1或Rg5。选用上述相同办法逐个解析判定并与对照品进行比对，终究断定4种人参皂苷，别离为人参皂苷Rk3，Rh4 ，Rk1，Rg5，见表1。
32 代谢产品的解析代谢物和母体药物一般都有相似的中心结构，依据中心结构的性质和一般代谢物的生物转化办法，预先搜集整理了各人参皂苷或许代谢物的相关信息。各人参皂苷在体内首要发作的代谢转化有：葡萄糖醛酸化，脱糖，硫酸化，脱羟甲基化，支链丢掉等。经过MarkerView软件，经过峰提取及相关处理后，运用PeakView中提取离子流色谱 （extract ion chromatogram，XIC）等功用，挑选精确的分子质量和碎片离子质量可较为容易地猜测代谢产品的元素组成。终究，在精确相对分子质量、相关的药物的生物转化常识以及母体药物的碎片裂解形式的基础上，判定代谢物结构。endprint
人参皂苷Rk3，Rh4 ，Rk1，Rg5的结构中替代基首要是甲基、糖基或许羟基，所以甲基、糖基和羟基的丢掉是其首要的磕碰诱导解离途径，另还或许存在葡萄糖醛酸化及硫酸化反响。归纳相关文献调研及前期斑马鱼代谢研讨成果，将或许的代谢产品开裂办法及代谢途径列出后剖析比对，见图2～5。在大鼠血浆、尿液和粪便样本中终究断定了15个或许的代谢产品，首要的11个代谢产品相关信息见表2。
来自母体化合物Rk3的葡萄糖醛酸化组合176，发生m/z 841591 9（M1）的甲酸缔合分子离子和其m/z 449293 5的产品离子。综上可以为M1是因为C3位葡萄糖醛酸化而发生的人参皂苷Rk3的葡萄糖醛酸化产品。依据人参皂苷Rk3的结构，M1为人参皂苷Rk33O葡萄糖醛酸盐。
NotR/min相对分子质量差错/×10-6m/z来历分子式称号
M1605841591 938449293 5粪便，血浆C42H68O14人参皂苷Rk33O葡萄糖醛酸盐
M21126679181 738571253 3，303136 6粪便C36H58O9脱水Δ20，21原人参三醇3O葡萄糖醛酸盐
M31130645468 828599351 1粪便，尿液C32H54O11S23脱2甲基丙烯基人参皂苷Rk33O硫酸酯
M41270457239 9-22303233 9粪便，血浆C30H50O3脱水Δ20，21原人参三醇
M51221987708 315464312 7粪便，血浆和尿液C48H78O18人参皂苷Rk112O葡萄糖醛酸盐
M61168825615 625433294 9粪便，尿液C42H68O13人参皂苷Rk212O葡萄糖醛酸盐
M7450957502 3-32436230 6，157221 4粪便，血浆C47H76O175″脱羟甲基人参皂苷Rk112O葡萄糖醛酸盐
M81148683420 036615230 1，479293 3粪便，血浆和尿液C36H60O10S人参皂苷Rk212O硫酸盐
M9432559380 3-30297244 3粪便，尿液C28H48O9S2′脱羟基，17脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O硫酸盐
M101080717451 5030671443 4，509385 4粪便，血浆C34H56O1317脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O葡萄糖醛酸盐
M111267701206 4-43641205 2，180902 4粪便，血浆和尿液C34H56O122′脱羟基，17脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O葡萄糖醛酸盐
m/z 679181 7（M2）的甲酸缔合分子离子和其m/z 517253 3，303136 6的产品离子比m/z 841591 9（M1）的甲酸缔合分子离子，在m/z 449293 5处的产品离子小162。因而，M2被判定为M1失掉1分子葡萄糖的产品，而且葡萄糖的丢掉方位被以为在C6位。依据M1的结构，M2为脱水Δ20，21原人参三醇3O葡萄糖醛酸盐。
在m/z 645468 8（M3）处的分子离子和其在m/z 599351 1处的产品离子，比人参皂苷Rk3在m/z 665431 8处甲酸缔合的分子离子多26。因而，M3被判定为人参皂苷Rk3丢掉2甲基丙烯基和硫酸化的产品，硫酸化和丢掉2甲基丙烯基的方位别离被以为是在C3位和C23位。依据人参皂苷Rk3的结构，M3为23脱2甲基丙烯基人参皂苷Rk33O硫酸盐。
经过162的中性丢掉发生对应于来自母体人参皂苷Rh4的葡萄糖丢掉的M4，其分子离子为m/z 457239 9，其产品离子在m/z 303233 9处。综上可以为M4是因为C6位处的葡萄糖丢掉，即人参皂苷Rh4失掉1分子葡萄糖所得产品。依据人参皂苷Rh4的结构，M4为脱水Δ20，21原人参三醇。
M5来自母体化合物Rk1的葡萄糖醛酸化，人参皂苷Rk1经过176的葡萄糖醛酸化组合发生m/z 987708 3（M5）处甲酸缔合的分子离子。因而，M5被以为是因为在C12位的葡萄糖醛酸化而引起的人参皂苷Rk1的葡糖醛酸化产品。依据人参皂苷Rk1的结构，M5为人参皂苷Rk112O葡萄糖醛酸盐。
在m/z 825615 6（M6）处甲酸缔合的分子离子和其在m/z 433294 9的产品离子比m/z 987708 3（M5）处甲酸缔合的分子离子小162，M5的产品离子在m/z 464312 7。因而M6被判定为M5脱1分子葡萄糖产品，而且其葡萄糖丢掉方位被以为是在C1″位。依据M5的结构，M6为人参皂苷Rk212O葡萄糖醛酸盐。
m/z 957502 3（M7）的甲酸缔合的分子离子及其在m/z 436230 6，157221 4的产品离子比m/z 987708 3（M5）处甲酸缔合的分子离子小30，其产品离子在m/z 464312 7处。因而，M7被判定为M5失掉1分子羟甲基产品，羟甲基丢掉方位被以为是在葡萄糖的C5′位。依据M5的结构，M7为5″脱羟甲基人参皂苷Rk112O葡萄糖醛酸盐。
m/z 683420 0（M8）的分子离子和m/z 615230 1，479293 3的产品离子比人参皂苷Rk2的分子离子多80。因而，M8被判定为人参皂苷Rk2的硫酸化产品，硫酸化方位被以为是在C12位。依据人参皂苷Rk2的结构，M8为人参皂苷Rk212O硫酸盐。
参加206，发生M9的分子离子m/z 559380 3，对应于母体化合物人参皂苷Rg5的脱糖，硫酸化，去1，5二甲基1，4己二烯基，脱羟基化反响。成果标明，母体化合物的离子首先在C3方位处脱糖，随后人参皂苷Rh3的离子硫酸化，脱1，5二甲基1，4己二烯基支链，脱羟基。因而，M9被以为是人参皂苷Rh3的硫酸化，失掉1，5二甲基1，4己二烯基支鏈的脱羟基产品。硫酸化，脱1，5二甲基1，4己二烯基和脱羟基化的方位别离是C12，C17和葡萄糖的C2′位。依据人参皂苷Rh3的结构，M9为2′脱羟基，17脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O硫酸盐。endprint
在m/z 717451 5（M10）处甲酸缔合的分子离子和m/z 671443 4，509385 4处的产品离子比母体化合物Rg5 m/z 766488 5处甲酸缔合的分子离子少95。因而，M10被判定为人参皂苷Rg5在C17位失掉1，5二甲基1，4己二烯基，C12方位处葡萄糖醛酸化和葡萄糖C1″方位处葡萄糖丢掉的产品，M10为17脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O葡萄糖醛酸盐。
在m/z 701206 4（M11）处甲酸缔合的分子离子和m/z 641205 2，180908 4处的产品离子比m/z 717451 5（M10）处甲酸缔合的分子离子小16，其产品离子在m/z 671443 4，509385 4处。因而，M11被判定为M10的脱羟基产品，而且脱羟基方位被以为是在葡萄糖的C2′位。依据M10的结构，M11为2′脱羟基，17脱1，5二甲基1，4己二烯基人参皂苷Rh312O葡萄糖醛酸盐。
4评论
本研讨运用UPLCQTOFMS/MS技能发现了蒸三七正丁醇部位中的4种人参皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5和其在大鼠体内的11个首要的代谢产品，并依据MS/MS精确质量信息对代谢物的结构进行了开始判定。成果标明，蒸三七正丁醇部位中4种人参皂苷的代谢途径包含葡萄糖醛酸化、脱糖、硫酸化、脱羟甲基化、支链丢掉等。其间，葡萄糖醛酸化的产品有M1，M2，M5，M6，M7，M10；脱糖反响的产品有M2，M4，M6，M7，M9，M10；硫酸化的产品有M3，M8，M9；脱羟甲基化的产品有M9，M11；支链丢掉的产品有M3，M9，M10。因11个代谢产品均存在于粪便中，故粪便中各人参皂苷的首要代谢产品均发作了上述代谢转化；血中人参皂苷的代谢转化以Ⅰ相代谢的脱糖反响为主；尿中人参皂苷的代谢转化以Ⅱ相代谢的葡萄酸醛酸化及硫酸化为主。
本文仅考虑蒸三七活性部位在体内的药动学及代谢产品的判定剖析，有关蒸三七醇提物（更能代表蒸三七）的体内代谢情况，可打开后续研讨，有利于更深入的知道蒸三七中外源性物质在体内的代谢情况及或许的转化途径。该研讨对蒸三七首要活性皂苷类组分即人参皂苷Rk3，Rh4，Rk1，Rg5在体内的代谢，从定性视点得到阐释，进一步清晰蒸三七在体内发挥药效的物质基础，亦为蒸三七的临床运用供给了参阅。
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[責任修改张燕]endprint