青木香和土木香 木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材的ITS2条形码分子判定
马晓冲+姚辉+邬兰+向丽+陈晓辰+宋经元
[摘要]经过剖析木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材的ITS2 （internal transcribed spacer 2）条形码序列，评论木香类药材判定新办法。对60份样品提取基因组DNA，PCR扩增ITS2序列并进行双向测序，所得序列经CodonCode Aligner拼接后，选用 MEGA5.0 软件进行序列比对，核算种内和种间遗传间隔（K2P），构建邻接树（neighbor-joing tree，NJ Tree）。成果标明，无论是菊科的木香、川木香、土木香，仍是马兜铃科的青木香和五味子科的红木香，ITS2序列种内变异均小于种间变异，ITS2序列一切单倍型比对后长度为272 bp，变异位点到达162个；遗传间隔显现物种种内均匀K2P远远小于种间均匀K2P；NJ树成果显现木香、川木香、土木香、青木香和红木香药材可显着差异，且能辨别川木香的2个基原物种。因而，ITS2序列可用于判定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材，为临床安全用药供给根据。
[关键词]DNA条形码；物种判定；ITS2 序列；菊科；马兜铃科；五味子科
木香、川木香、土木香、青木香、红木香5种木香类药材因为药材外形、气味、成效类似或许存在同名异物或同物异名等原因简单混杂，构成判定困难，可是这5种木香药材来历于不同的基原植物，木香Aucklandiae Radix为菊科Asteraceae植物木香Aucklandia lappa Decne.的枯燥根，又称为广木香或云木香；川木香Vladimiriae Radix为菊科植物川木香Vladimiria souliei （Franch.） Ling、灰毛川木香V. souliei （Franch.） Ling var. cinerea Ling的枯燥根；土木香Inulae Radix为菊科植物土木香Inula helenium Ling.的枯燥根，又称为青木香或祁木香；青木香Aristolochiae Radix为马兜铃科Aristolochiaceae植物马兜铃Aristolochia debilis Sieb.et Zucc.的枯燥根；红木香Kadsurae Radix为五味子科Schisandraceae植物南五味子Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.的枯燥根，又称土木香[1-3]。
木香类药材用药历史悠久，但5种木香类药材呈现混用、替代，构成商场上木香类药材紊乱。木香是常用药材，从梁代开端经广州进口的进口货，称广木香，因其质量较优，逐步成为干流品种。后在云南引种成功，称云木香，是现存木香药材的干流品种[4]，具有行气止痛、健脾消食的成效 [1]。现代药理研讨标明木香对消化体系、心血管体系、呼吸体系以及多种肿瘤细胞有切当的效果[5-9]。川木香是原产我国的道地药材，主产于四川西部，曾是木香的代用品和当地习用品[3-4]。川木香药材的成效与木香类似但偏重不同，药典中独自收载，应差异运用。可是川木香、灰毛川木香与木香首要有效成分均为去氢木香内酯、木香烃内酯，研讨标明三者的指纹图谱，气相色谱类似度很高[10-13]，不易差异。Shum等[14]也经过GS-MS剖析木香、川木香和灰毛川木香等物种挥发油成分，聚类剖析标明可以差异木香与混伪品，但检测办法杂乱，且无法差异川木香和灰毛川木香。土木香也曾作为木香的代用品[3-4]，土木香与木香的化学成分差异较大，其首要药效成分为土木香内酯和异土木香内酯，具有健脾和胃、行气止痛、安胎的成效[1]，现已替代马兜铃科青木香。2010年版《我国药典》仅收载木香、川木香、土木香3种木香类药材，其他的木香类药材已不予收载。青木香开始作为木香代用品种呈现[4]，但现代研讨标明马兜铃科植物中含有马兜铃酸，能引起肾毒性不良反响[15-16]，已于2004年撤销青木香药品规范，凡中成药处方中含有青木香的药材将用土木香I. helenium L.枯燥根替代。红木香是木香的混杂品，性味功能与木香差异大，性温、味辛，有行气、活血、止痛的成效[3]。总的来说，木香类药材原始品种、当地习用品、代用品和混杂品种类繁复，情况杂乱，经过传统办法判定或化学成分检测不能很好的进行差异，不利于木香类药材规范化安全用药，需求寻觅一种快速、精确的分子判定办法，以保证临床安全用药。
DNA条形码技能具有较强通用性，作为物种判定新手法，倍受国内外研讨者重视[17-23]，现在，DNA条形码分子判定辅导准则现已获准归入《我国药典》2010年增补本[24]。Chen等[25]提出ITS2 序列可以作为规范DNA条形码辨别药用植物及其近缘物种。ITS2片段具有合适扩增和测序的长度，在物种水平的变异较快，有更多的突变位点以差异不同的物种，因而，在DNA条形码判定物种方面具有潜在的研讨价值。Yao等[26]根据大样本量剖析证明ITS2 序列可以作为植物物种辨别的通用条形码。本文运用ITS2序列对5种木香药材进行判定，为临床安全用药供给根据。
1 资料
木香药材样品（根）来历于云南、四川、西藏，包括药材商场购买、药店购买、野生采挖共20份；叶片样品1份，来历于云南。川木香药材样品（根）6份，灰毛川木香药材样品（根）16份，来历于主产区四川，包括野生采挖、药材商场购买；川木香叶片样品1份，来历于我国医学科学院药用植物研讨所1961年标本，灰毛川木香叶片样品1份，来历于我国医学科学院药用植物研讨所1974年标本；土木香药材样品（根）11份，来历于西藏，包括药材商场购买、野生采挖；叶片样品1份，来历于河南南阳。马兜铃药材样品（根）2份，来历于江西；叶片样品1份，来历于四川成都；木香3条ITS2序列，南五味子3条ITS2序列均由GenBank 下载的ITS 序列剪切而来。研讨样本经我国医学科学院药用植物研讨所林余霖研讨员和成都中医药大学国锦林教授判定，凭据标本保存于我国医学科学院药用植物研讨所。试验资料详见表1。endprint
2 办法
木香、川木香、土木香和马兜铃的枯燥根均用75%乙醇擦洗药材外表后，刮去外表皮，取根的内部约45 mg，用DNA 提取研磨仪 （Retsch MM400，Germany） 研磨2 min（30 次/s） 后，水浴56 ℃8～12 h。运用植物基因组DNA提取试剂盒 （Tiangen Biotech Co.，China） 提取总DNA。提取过程中，氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次，沉积DNA过程时，用-20 ℃预冷的异丙醇沉积DNA ，摇匀，放入-20 ℃冰箱冷冻30 min，用50 μL水洗脱。叶片的DNA提取办法彻底依照Chen等[25]研讨的办法。PCR 扩增、测序引物正向ITS2F为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向ITS3R为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[25]。 PCR 反响体积为25 μL，体系内包括PCRmix 12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL，模板DNA 约 20～100 ng。扩增程序： 94 ℃变性5 min；再进行40个循环 （94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）；最终72 ℃延伸10 min[25]。PCR 扩增产品经纯化后，运用ABI3730XL 测序仪进行双向测序。测序峰图运用CodonCode Aligner V 3.7.1（CodonCode Co.，USA） 校正拼接，去除引物区。对拼接后得到的序列选用根据隐马尔可夫模型的HMMer注释办法去除两头5.8S和28S区段即可取得ITS2间隔区序列[27]。然后，将一切序列用软件MEGA5.0剖析比对[28]，并根据K2P 模型进行遗传间隔等剖析，用邻接 （NJ） 法构建体系聚类树，运用bootstrap（1 000次重复）查验各分支的支持率。
3 成果
3.1 木香、川木香、土木香、青木香、红木香种内种间序列特征剖析
3.1.1 种内变异剖析 木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃、南五味子ITS2序列比对后的长度，GC含量均匀值和变异位点个数等信息见表2。木香种内不同来历样品21条ITS2序列长度均为223 bp，分为2个单倍型（表1），单倍型A1包括18条ITS2序列，与3条GenBank序列相同，单倍型A2序列包括2条，在195位点有C-G变异。川木香种内7条ITS2序列长度为223 bp，分为2个单倍型（表1），其间单倍型B1序列包括2条，在8位点有C-T变异，162位点有A-G变异。灰毛川木香17条ITS2序列比对后长度为223 bp，仅有1个单倍型，无变异位点。土木香12条序列比对后长度为228 bp，无变异位点，GC含量在6个物种中最低。马兜铃3条ITS2序列比对后长度为264 bp，分为2个单倍型（表1），单倍型E1包括1条，单倍型E2序列2条，在47位点有T-A变异，GC含量最高到达78%。南五味子JF976709和JF976710序列相同，JF976712在109位点有G-A变异。
3.1.2 种间变异剖析 木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃、南五味子种间ITS2序列两两比对后的长度和变异位点个数见表3。木香与其他木香ITS2序列比对长度规模为223～264 bp，变异位点规模为13～104个，与川木香和灰毛川木香差异小，与马兜铃差异最大。川木香和灰毛川木香序列比对后，变异位点为2个，种间差异最小。土木香与马兜铃种间差异最大，变异位点到达115个。木香、川木香、土木香、青木香、红木香ITS2序列比对长度272 bp，变异位点162个，见图1。
3.2 木香、川木香、土木香、青木香、红木香种内种间遗传间隔剖析
3.2.1 种内遗传间隔剖析 根据K2P模型核算遗传间隔，ITS2序列种内种间均匀K2P间隔见表4。木香ITS2序列种内均匀K2P间隔为0.001，种内最大K2P间隔为0.004；川木香ITS2序列种内均匀K2P间隔为0.004，种内最大K2P间隔为0.009；灰毛川木香和土木香种内K2P间隔为0；马兜铃3条ITS2序列种内均匀K2P间隔为0.003，种内最大K2P间隔为0.004；南五味子种内均匀K2P间隔为0.003，种内最大K2P间隔为0.004。
3.2.2 种间遗传间隔剖析 木香与其他木香药材ITS2序列种间均匀K2P间隔为0.176，种间最小K2P间隔为0.047，大于种内最大K2P间隔；土木香与其他木香药材ITS2序列种间均匀K2P间隔为0.298，种间最小K2P间隔为0.247，大于种内最大K2P间隔；马兜铃和南五味子与其他木香药材ITS2序列种间均匀K2P间隔分别为0.748，0.705；川木香和灰毛川木香与其他木香药材ITS2序列种间均匀K2P间隔分别为0.134，0.158，而川木香和灰毛川木香种间K2P间隔为0.005，小于种内最大间隔。
3.3 木香、川木香、土木香、青木香、红木香邻接树（NJ树）判定
为了更直观的显现判定成果，本文根据ITS2序列构建了木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和马兜铃NJ树，见图2，成果标明木香与土木香，马兜铃和南五味子各自聚为一支。川木香和灰毛川木香构成1个独立支，川木香聚在2个小枝上，与灰毛川木香差异开，因而ITS2作为条形码可精确差异木香、川木香、灰毛川木香、土木香、南五味子和马兜铃。
4 评论
ITS2条形码序列可以精确且安稳的判定木香、川木香、土木香、青木香、红木香药材。根据ITS2条形码序列构建的NJ树和种内种间遗传间隔剖析，初次证明ITS2条形码序列可以精确的判定并差异5种木香药材，一起也能精确的差异川木香的2个基原植物。Chen等[29]运用分子技能判定木香与相关物种，但所运用对错通用引物，有必定局限性，不适宜推行，而DNA条形码是运用基因组中一段公认规范的、相对较短的DNA片段来进行物种判定，该办法易于共同、规范化，是中药分子判定办法学上的立异[23]。川木香和灰毛川木香是菊科同属植物，传统形态学判定经过叶片背部绒毛差异，关于产品药材判定就愈加困难，Shum等[14]也运用GS-MS聚类剖析川木香和灰毛川木香的挥发油成分，成果显现未差异开。本文中运用ITS2条形码序列对川木香和灰毛川木香进行判定，为二者的判定供给新的办法和根据。endprint
别的，本研讨证明ITS2序列作为判定木香类药材有很好的安稳性。对木香、川木香、灰毛川木香、土木香、马兜铃和南五味子6个物种种内变异剖析标明，6个物种ITS2序列种内均匀K2P间隔均较小，种内遗传变异小。从木香、川木香、灰毛川木香和土木香基原叶片取得ITS2条形码序列的单倍型与药材取得的单倍型共同。从木香药材取得的单倍型与GenBank提交的木香ITS2序列比对后，发现本研讨收集的木香药材DNA条形码单倍型悉数包括GenBank提交序列。
本研讨中川木香叶片样本为1961年标本，灰毛川木香叶片样本为1974年标本，选用叶片提取办法进行DNA提取，虽然年代久远，DNA降解严峻，但ITS2条形码具有序列长度短和判定效率高的特色，仍能安稳取得ITS2条形码序列，证明ITS2序列在判定年代久远的标本上具有显着的优势。
木香、川木香、灰毛川木香和土木香药材中的化学成分首要为挥发油，多糖和酚类含量少，所以在DNA提取中较为简单，首要留意以下几点：①因为这4种木香的药用部位是根部，根部的DNA含量比较少，尤其是贮存时刻长的产品药材，其DNA含量降解严峻，所以需求恰当的加大取样量，以到达PCR扩增的DNA浓度，在本研讨中经过屡次挑选发现取样量约45 mg的效果较好；②恰当的延伸水浴时刻，有利于细胞裂解，DNA溶出，本试验发现56 ℃水浴8～12 h效果较好；③沉积DNA过程时，用-20 ℃预冷的异丙醇沉积DNA，摇匀，放入-20 ℃冰箱冷冻30 min，使DNA可以充沛的沉积；④留意真菌污染的问题，因为ITS2 片段在植物和真菌中广泛存在，若药材外表被真菌污染，在PCR 时会存在将真菌的ITS2序列扩增出来的可能性。木香类药材是以根入药，与土壤中的真菌触摸，需求进行清洁并削去外皮，取内部安排。别的，为了调查取得序列的正确性，作者将序列与GenBank数据库进行比对显现序列均为正确序列，不存在真菌污染。
在植物的ITS2条形码序列中，种内变异广泛存在，不同植物ITS2序列中种内遗传变异的丰厚程度不同，例如在蓼科植物唐古特大黄的ITS2片段中存在丰厚的种内遗传变异[30]，而五加科植物人参的ITS2序列中仅存在1种单倍型[31]。Song等[31]研讨标明虽然植物ITS2序列中种内变异频频，但在大多数情况下，ITS2序列的首要变异可以精确判定物种。为验证文中树立的根据ITS2 条形码序列判定的精确性和牢靠性，特从北京某药店购买木香、川木香和土木香药材，每种药材随机取2个样本，由分类学家开始判定药材正确，然后根据本研讨树立的办法成功提取DNA，试验成果证明木香的2份样本均为木香，ITS2序列类型为A1；土木香的2份样本均为土木香，ITS2序列类型为D1；川木香的2份样本为灰毛川木香，ITS2序列类型为C1。本研讨不只处理了不具备分类布景常识的操作人员判定难题，也处理了传统判定和化学判定对木香类药材判定中的困难，并能精确判定到物种，使木香类药材辨别办法简便易行，为临床安全用药供给牢靠根据。
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Molecular identification of Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，
Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae
Radix using ITS2 barcode
MA Xiao-chong1，YAO Hui1，WU Lan2，XIANG Li2，CHEN Xiao-chen1，SONG Jing-yuan1*
（1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Unionendprint
Medical College，Beijing 100193，China；
2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）
[Abstract] In order to identify Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix using ITS2 barcodes，genomic DNA from sixty samples was extracted and the ITS2 （internal transcribed spacer） regions were amplified and sequenced. The genetic distances were computed using MEGA 5.0 in accordance with the kimura 2-parameter （K2P） model and the neighbor-joining （NJ） phylogenetic tree was constructed. The results indicated that for Aucklandiae Radix （Aucklandia lappa），Vladimiriae Radix （Vladimiria souliei and V. souliei var. cinerea），Inulae Radix （Inula helenium），Aristolochiae Radix （Aristolochia debilis） and Kadsurae Radix （Kadsura longipedunculata），the intra-specific variation was smaller than inter-specific one. There are 162 variable sites among 272 bp after alignment of all ITS2 sequence haplotypes. For each species，the intra-specific genetic distances were also smaller than inter-specific one. Furthermore，the NJ tree strongly supported that Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix can be differentiated. At the same time，V. souliei （Dolomiaea souliei） and V. souliei var. cinerea（D. souliei var. cinerea） belonging to Vladimiriae Radix were clearly identified. In conclusion，ITS2 barcode could be used to identify Aucklandiae Radix，Vladimiriae Radix，Inulae Radix，Aristolochiae Radix and Kadsurae Radix. Our study may provide a scientific foundation for clinical safe use of the traditional Chinese medicines.
[Key words] DNA barcoding； species identification； ITS2； Asteraceae； Aristolochiaceae； Schisandraceae
doi：10.4268/cjcmm20141204endprint