纳米资料有哪些 不同纳米资料作为基因载体的功率比较
董亚贤+尧慧燕+梁兵+钟高贤+刁芳明+石红婷
【摘要】 意图 比较不同靶向纳米资料作为基因载体的细胞毒性巨细及其转染功率。办法 以聚乙烯亚胺（PEI）为对照， 化学组成髓鞘碱性蛋白68-86（MBP68-86）-多聚赖氨酸（PLL）-聚乙烯亚胺-聚乙二醇（PEG）接枝支化特异性配体乳铁蛋白 （Lf）及PLL-PEI-PEG， 并选用MTT法检测细胞毒性， 倒置显微镜荧光观察法和流式细胞仪法检测转染效果。成果 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf细胞毒性比PLL-PEI-PEG及PEI低， 三组两两比较差异有统计学含义（P<0.05）；MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染功率为（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染功率为（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 为的转染功率（20.5±1.2）%， 两两比较差异有统计学含义（P<0.05）。定论 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG可作为基因转染的传输载体， 其间MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf最好。
【要害词】 纳米资料； MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf；基因载体；PLL-PEI-PEG
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.193
现在一切的基因治疗研讨范畴， 都存在转基因载体体系在转染功率、定向性、可控性、安全性等方面的缺乏[1]。而纳米载体凭仗其低毒、高效负载等优点在基因治疗中发挥越来越重要的效果。作者前期试验现已成功组成并验证了PLL-PEI-PEG[2] 。因而， 本文在前期试验的基础上合MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf， 并在体外比较不同新式靶向纳米资料的细胞毒性和转染功率， 以筛选出愈加高效、低毒和高靶向性的基因载体， 为神经体系的基因治疗带来新的期望。
1 资料与办法
1. 1 细胞来历及培育 大鼠单个核细胞（PBMC）购自美国ATCC公司， 由本试验室保存。选用加有10% 胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM培育基培育。
1. 2 PLL-PEI-PEG-Lf/MBP68-86的制备 MBP68-86用Traut试剂硫酸化后再与纳米资料以分子比4∶1混合， 在室温下反响1h， 去除过剩的MBP68-86。
1. 3 质粒DNA（pDNA）的制备 质粒在大肠杆菌中扩增， 然后用质粒提取试剂盒提取纯化。得到的质粒经过紫外分光光度计检测其纯度和浓度。检测合格的质粒保存于-20℃保存备用。
1. 4 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/质粒DNA复合物的制备 在Eppendorf管中， 将1 μg pDNA稀释在50 μl不含FBS的DMEM中， 振动均匀， 按不同N/P比把相应量的纳米资料加入到别的一管装有50 μl不含FBS的DMEM的Eppendorf管中， 然后把两溶液在室温下振动5min得到均匀复合物。
1. 5 细胞毒性 选用四唑盐（MTT）比色法检测细胞毒性， 详细办法拜见文献[2]。
1. 6 细胞转染功率 选用倒置荧光显微镜观测转染成果， 并选用流式细胞术检测转染功率， 详细转染进程及检测办法拜见文献[2]。
1. 7 统计学办法 选用SPSS17.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表明， 选用t查验；计数资料以率（%）表明， 选用χ2查验。P<0.05表明差异具有统计学含义。
2 成果
2. 1 细胞毒性检测成果 选用MTT检测细胞毒性。当N/P<10时， 三种纳米资料载体的细胞存活率都>80%；在N/P=15时， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP为78%， PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP为63%， 比PEI/pAAV-EGFP的细胞存活率（52%）要高， 两两比较差异有统计学含义（P<0.05）；N/P<15时， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP和PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的存活率适当， 但两者比PEI25kD/pAAV-
EGFP要高， 只是在N/P>15时MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP的细胞存活率才比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP低， 两两比较差异有统计学含义（P<0.05）。
纳米资料构成复合物后在PBMC细胞中的细胞毒性。见图1。
2. 2 细胞转染效果
2. 2. 1 倒置荧光显微镜观测细胞转染效果 选用倒置荧光显微镜观测细胞转染效果， 发现在N/P=15时载体绿色荧光蛋白表达量最多， 一起MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的细胞荧光表达效果比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP要好。
2. 2. 2 流式细胞仪检测细胞转染效果 本试验还使用流式细胞仪检测了N/P=15时三种纳米资料的转染功率， 成果发现MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的转染功率为（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的转染功率为（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 为的转染功率（20.5±1.2）%， 两两比较差异有统计学含义（P<0.05）。
3 评论
新式纳米资料作为基因载体具有杰出的安全性和生物相容性[3]。近来许多试验[4， 5]经过改动阳离子聚合物的结构或对其进行化学润饰而降低毒性， 并完成高转染功率。在曾经的工作中， 作者现已成功组成并验证了靶向、高效及可降解型PLL-PEI-PEG基因载体， 并作了相关的报导[2]。因为乳铁蛋白（Lf）可经过受体介导的跨细胞转运经过血脑屏障。考虑到这一点， 作者拟将Lf首要结构序列连接到PEG结尾， 从而使这种纳米资料PLL-PEI-PEG-Lf可经过跨细胞转运进入脑安排。虽因PLL-PEI-PEG-Lf可透过血脑屏障进入脑安排， 但对脑的不同安排并无特异性。因而本试验在PEG的基础上加以MBP68-86润饰， 使新的载体一起具有血脑屏障穿透性和活化的免疫细胞靶向性。
相同用量的时分MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的毒性最低。基因载体除了应具有较低的毒性， 较高的转染功率也十分要害。MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的转染效果较PLL-PEI-PEG及PEI好， 别的流式细胞仪检测也证明了相同的成果。由此能够得出MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为基因传输载体较好。
综上所述， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG都可作为基因传输的载体， 但因为MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作为PLL-PEI-PEG的改善品， 各方面的功能都优于PLL-PEI-PEG， 因而具有更高的可塑性和价值。
参考文献
[1] 梁兵， 袁芳， 杨宁， 等. 3种不同类型基因导入体系转染类神经元细胞的功率比较.重庆医学， 2012， 41（18）：1792-1798.
[2] 董亚贤， 石红婷， 梁兵， 等. 新式靶向纳米资料作为基因载体的评价. 现代防备医学， 2015， 42（13）：2405-2408.
[3] 梁兵， 袁芳， 殷建瑞， 等. 纳米资料PEG-PEI介导双基因促体外拟神经细胞凋亡的效果. 山东医药， 2012， 52（25）：1-4.
[4] 谢黎崖， 胡权， 吴永良， 等.叶酸和聚乙二醇双润饰的壳聚糖纳米粒的制备及其功能表征.我国现代使用药学， 2013， 30（3）：284-289.
[5] 刘文文， 王晓梅， 赵永波， 等.重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染.中风与神经疾病杂志， 2005， 22（2）：104-106.
[收稿日期：2016-03-31]