呼出气冷凝液 呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21检测对孤立性肺结节前期肺癌的确诊价值及临床相关性研讨

罗家友 周凌燕 张丽娟 华锋 马志红 沈绮斌 王斌 崔恩海

[摘要] 意图 探討呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、P53蛋白、miRNA21在肺癌组患者中的确诊价值及临床相关性。 办法 随机挑选2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科的胸外科孤立性肺结节需手术切除患者51例，依据术后病理将孤立性肺结节患者分为肺癌组35例、非肺癌组16例，同期体检者12例为对照组。一切患者均搜集呼出气冷凝液、空腹静脉血。选用全自动化学发光免疫剖析仪测定CEA水平、酶联免疫吸附试验测定P53蛋白水平、实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR法）测定miRNA21水平，剖析呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21对孤立性肺结节前期肺癌的确诊价值。 成果 肺癌组EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21表达水均匀高于非肺癌组与对照组（P<0.05）；肺癌组患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平与性别、年纪、TNM、病理类型差异均无计算学含义（P>0.05）；联合检测EBC的CEA、P53蛋白、miRNA21对孤立性肺结节前期肺癌的确诊灵敏性、特异性均优于单项检测（AUC 0，931 P<0.05）。 定论 联合检测呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺结节前期肺癌的筛查，进步确诊的灵敏性和特异性。

[关键词] 呼出气冷凝液；癌胚抗原；P53蛋白；miRNA21；孤立性肺结节；前期肺癌、确诊价值；相关性

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）07-0005-04

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value and clinical correlation of exhaled breath condensate（EBC） carcinoembryonic antigen（CEA）， P53 protein and miRNA21 in lung cancer patients. Methods 51 patients with solitary pulmonary nodules in need of surgical incision who were admitted to the department of respiratory medicine and the department of thoracic surgery in our hospital from December 2014 to June 2017 were randomly selected. According to the postoperative pathology， the patients with solitary pulmonary nodules were divided into lung cancer group（n=35）， non-lung cancer group（n=16）. In the same period， 12 cases receiving physical examination were selected as the control group. Exhaled breath condensate and fasting venous blood were collected in all patients. The CEA level was measured by using the automatic chemiluminescence immunoassay analyzer. The level of P53 protein was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） and the level of miRNA21 was tested by real-time fluorescence quantitative PCR（RT-PCR）. The diagnostic value of exhaled breath condensate CEA， P53 protein and miRNA21 in solitary pulmonary nodules in early stage of lung cancer was analyzed. Results The levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were significantly higher than those in non-lung cancer group and control group（P<0.05）； the levels of CEA， P53 protein and miRNA21 expression of EBC in lung cancer group were not statistically significantly different from those in gender， age， TNM and pathological types（P>0.05）； the diagnostic sensitivity and specificity of combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC in solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer were better than single detection（AUC 0.931， P<0.05）. Conclusion Combined detection of CEA， P53 protein and miRNA21 of EBC is helpful for the screening of solitary pulmonary nodules in the early stage of lung cancer and improve the sensitivity and specificity of diagnosis.

[Key words] Exhaled breath condensate； Carcinoembryonic antigen（CEA）； P53 protein； miRNA21； Solitary pulmonary nodules； Early lung cancer； Diagnostic value； Correlation

肺癌是最常见的恶性肿瘤，是发病率榜首、最丧命的恶性肿瘤之一，我国的肺癌占全球1/3以上[1，2]，因为起病藏匿，前期缺少典型临床症状，70.0%以上患者确诊时已经是中、晚期，损失手术铲除时机，严峻影响公民健康[3]，因而对前期肺癌的筛查成为呼吸科研讨的热门。本课题随机挑选2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的需手术切除的孤立性肺结节肺癌患者51例作为研讨目标，评论呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21对前期肺癌的筛查价值及临床相关性，现报导如下。

1 材料与办法

1.1 一般材料

随机挑选2014年12月～2017年6月入住我院呼吸科、胸外科的孤立性肺结节需手术切除患者51例，依据术后病理分为肺癌组和非肺癌组。肺癌组男23例，女12例，年纪42～75岁，均匀（63.27±7.92）岁，病灶直径0.8～3.0 cm；病理类型：鳞癌5例，腺癌30例；TNM分期：Ⅰa期18例、Ⅰb期11例、Ⅰc期6例。非肺癌组16例，男10例，女6例，年纪40～76岁，均匀（64.09±7.97）岁，病灶直径0.9～2.9 cm。挑选同期健康体检者12例作为对照组，男7例，女5例，年纪50～57岁，均匀（53.50±4.31）岁。本课题得到医院道德委员会赞同，患者及家族对医治计划具有知情权。三组的性别、年纪等一般材料比较差异无计算学含义（P>0.05），具有可比性。

1.2 归入及扫除规范

归入规范：（1）契合孤立性肺结节肺癌、孤立性肺结节非肺癌临床确诊规范者[7]；（2）终究均经过印象学查看、手术病理或安排学查看得到确诊；（3）能遵从医嘱完结相关查看及确诊者。扫除规范：（1）肺内多发结节或最大直径大于3.0 cm肿块；（2）兼并其他恶性肿瘤及全身免疫性疾病者；（3）严峻心肺疾病不能耐受呼出气冷凝液查看。

1.3 办法

13.1 EBC搜集 EBC搜集选用EricJaeger Company出产的EcoScreen冷凝器搜集，一切研讨目标要求禁食禁烟12 h，于晨起空腹时进行EBC搜集，在EBC搜集之前半小时，不做用力肺活量、时刻肺活量、最大通气量查看。受试者漱口清洁口腔，在25℃的室温环境下进行安静呼吸，戴鼻夹经过单向活瓣安静呼吸，呼出气在搜集器-5℃低温搜集管中可冷凝变为液状物，取出搜集管，将搜集到3～4 mL的EBC装入无菌标本管内，然后当即置于-70℃低温冰箱内保存。搜集过程中若有唾液或痰液随时将其吐出，以防止影响检测成果。对一切搜集的EBC检测唾液淀粉酶扫除唾液的污染，若唾液淀粉酶检测阳性需次日从头搜集并到达要求。

1.3.2 血清搜集 搜集51例孤立性肺结节患者、12例健康体检者的外周静脉血5 mL，10 min离心，速度为5000 rpm，细心抽取上层血清，将其放置在-70℃冰箱中保存。

1.3.3 檢测办法 选用全自动化学发光免疫剖析仪测定CEA水平；选用酶联免疫吸附试验测定三组P53蛋白水平，有关操作严厉遵从试剂盒、仪器说明书完结；选用实时荧光定量PCR（RT-PCR法）测定三组miRNA21水平。选用反转录试剂盒（ABI公司出产供给）完结miRNA的反转录，确保反转录整个体系为15 μL，经过查阅Sanger micro-RNA序列取得miRNA21相应的序列引物，依据每一位标本状况设置反转录条件：16℃下30 min，42℃下30 min，85℃下5 min，最终在4℃下坚持恒温，将取得的反转录产品选用RT-PCR体系完结定量检测，确保整个反响体系为20 μL，设置PCR检测反响条件：95℃下10 min，95℃下15 s，60℃下1 min，接连进行40个循环。最终经过PCR自带软件取得基线与阈值后，将miR16作为内参，读取相应miR16、miR21循环阈值，核算两种循环阈值，选用两种循环阈值标明miRNA21表达水平[8，9]。

1.4 调查目标

（1）调查肺癌组与非肺癌组及对照组呼出气冷凝液、空腹静脉血中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平状况。（2）调查肺癌组各亚组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平差异性；（3）评价联合与单一检测EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21在前期肺癌的确诊灵敏性、特异性。

1.5计算学办法

选用SPSS18.0软件处理，计数材料行χ2查验，选用[n（%）]标明，计量材料以（x±s）标明，选用t查验，对EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21确诊效能制作ROC曲线，与规范曲线进行比较取得灵敏性、特异性参数，P<0.05标明差异有计算学含义。

2 成果

2.1 三组CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平比较

肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水均匀高于非肺癌组与对照组（P<0.05），但血清检测成果与非肺癌组和对照组无计算学差异（P>0.05）；非肺癌组与对照组EBC及血清中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平差异无计算学含义（P>0.05）。见表1。

2.2 肺癌组临床特征与EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21相关性

肺癌组患者EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平与性别、年纪、TNM分期、病理类型无计算学差异（P>0.05）。见表2。

2.3 肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21确诊效能

单项检测CEA、miRNA21对前期肺癌确诊灵敏性和特异性较P53蛋白高（P>0.05）；联合检测CEA、P53蛋白、miRNA21确诊肺癌的灵敏性、特异性高于单一检测（AUC 0.931，P<0.05）。见表4、封三图1。

3 评论

肺癌是临床上常见的疾病，具有发病率高、死亡率高、治愈率低一级特色，跟着我国工业化程度的进程、空气雾霾的加重，肺癌发病率呈显着上升趋势，严峻影响我国居民健康[4]。孤立性肺结节（pulmonary nodule）是指鸿沟清楚、印象学不透明而且直径≤3 cm，周围彻底被含气肺安排包绕的肺部结节[5-6]。大都肺癌患者[7-8]发病前期以孤立性结节为首要体现，肺癌、淋巴瘤、肺转移性肿瘤、肉芽肿、特异性肉芽肿感染均可体现为肺结节，虽然高分辩CT能为咱们供给较多的印象学信息，但仍有较高的误诊率[9-10]。呼出气冷凝液（exhaled breath condensate，EBC）检测办法是一种新的无创搜集下呼吸道挥发性及非挥发性物质的办法，具有无创伤、搜集简略、患者易承受、可重复进行等长处。很多研讨标明，在确诊非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EBC中能查看多种肿瘤目标，且具有较高的灵敏性、特异性，或许成为肺癌前期确诊、筛查肿瘤高危人群的一种新途径[11-12]。

CEA是一种富含多糖的蛋白复合物。对肿瘤的确诊、预后、复发判别有含义，是检测肿瘤的首选标志物之一。miRNA与肿瘤密切相关，在人类基因组中已判定的1000多个miRNA中，2002年Calin GA等[6]初次提醒了miRNA的反常调控与肿瘤的相关性。因为miRNA与很多肿瘤相关，故外周血检测成果很难断定与肺癌相关性，EBC来自于肺部，其间所含的微量miRNA首要来自于肺部，故对EBC中miRNA的检测有助于肺癌的确诊，有研讨显现[13-15]，miRNA21在NSCLC的血和EBC中高表达。本研讨显现，孤立性肺结节肺癌组EBC中CEA浓度、miRNA21与非肺癌组及对照组有计算差异，与肺癌的分期及病理类型无相关性，对肺癌确诊的灵敏性及特异性均较高（AUC：0.875、0.892，P<0.05），是筛查前期肺癌的较为灵敏目标[16-17]。P53蛋白是一种由-53抑癌基因编码的蛋白，能直接参与機体细胞周期的调控、DNA的修正与组成。P53基因发作骤变后将会形成癌变、骤变型P53蛋白呈高表达[18]。本研讨成果显现，非小细胞肺癌患者EBC中p53蛋白的浓度显着高于非肺癌组及对照组，与肺癌的分期、病理类型及分解程度无差异，与有些文献[19-20]报导相符，但EBC中P53蛋白对孤立性肺结节前期肺癌筛查的灵敏性和特异性较CEA和miRNA21低（AUC 0.706，P>0.05），或许与EBC中P53蛋白来自于除肺以外的多个部位如咽部、口腔等有关。本研讨显现，孤立性肺结节肺癌组EBC中CEA、P53蛋白、miRNA21表达水平，均高于非肺癌组与对照组（P<0.05），与性别、年纪、TNM、病理类型无计算学含义（P>0.05），三项目标对前期肺癌确诊灵敏性及特异性比较发现，CEA、miRNA21比较P53蛋白好，三项联合检测灵敏性及特异性更高（AUC 0.931，P<0.05），能发挥不同检测目标优势，到达优势互补，进步孤立性肺结节前期肺癌的筛查准确率，改进患者预后，值得临床试验性使用并进一步验证。

综上所述，联合检测呼出气冷凝液CEA、P53蛋白、miRNA21有助于孤立性肺结节前期肺癌的筛查，进步确诊的灵敏性和特异性。

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（收稿日期：2017-09-28）