动力学稳定性 常山碱稳定性及其降解动力学研讨
张继远 刘晓谦 杨立新 冯伟红++王智民++李春
[摘要]對常山碱的安稳性及其降解动力学进行研讨。成果表明，24 h内活动相作溶剂时，常山碱含量仅下降1%，但在水、甲醇、50%甲醇及10%乙腈溶液中其含量下降为开始含量的90%。当溶液pH介于3～7时，24 h内常山碱的保存率在98%以上，但在碱性溶液中（pH 90）含量下降约12%。温度越高，常山碱安稳性越差，40～80 ℃放置10 h后，常山碱降为开始含量的60%左右，但在20 ℃下放置10 h，其含量仅下降约5%；40，60 ℃放置10 h，常山碱首要转化为异常山碱，二者的总含量较开始总含量根本不变，可是80 ℃下放置10 h，常山碱和异常山碱的总含量下降为开始总含量的8333%，阐明高温下常山碱结构发作了彻底改动，而不仅仅是异构化为异常山碱。光照对常山碱安稳性影响显着，强光照耀108 h，常山碱质量分数较开始含量下降23%左右，但在避光和天然光条件下，其含量仅下降10%左右。不管在人工胃液（pH 14）仍是人工肠液（pH 68）中，放置10 h后，常山碱质量分数下降均小于5%。常山碱固体在高温（60 ℃）、高湿[（75±1）%]和强光（3 000 lx）照耀下放置10 d后，其含量别离削减027%，76%，539%。常山碱在水、甲醇、50%甲醇和10%乙腈溶剂中、碱性溶液、不同光照和不同温度（20，40 ℃）下的降解根本契合化学动力学一级反响。因而，不管是常山碱的制备纯化仍是相关制剂的出产，都应在偏酸性溶液，低温、避光条件下快速操作完结，而常山碱固体则应在枯燥、避光条件下保存。
[关键词]常山碱；安稳性；高效液相色谱法
Investigation on stability and degradation kinetics of febrifugine
ZHANG Jiyuan1，2，3， LIU Xiaoqian2，3， YANG Lixin2，3， FENG Weihong2，3， WANG Zhimin2，3*， LI Chun2，3
（1. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China；
2. China Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；
3. National Engineering Laboratory for Quality Control Technology of Chinese Herbal Medicines， Beijing 100700， China）
[Abstract]To investigate the stability and degradation kinetics of febrifugine The results showed that within 24 hours， febrifugine content was decreased by only 1% in mobile phase solvent， but its content was decreased to be 90% of the initial content in the water， methanol， 50% methanol and 10% acetonitrile solution When the pH value of the solution was between 3 and 7， the retention rate of febrifugine in 24 hours was over 98%， but its content was decreased by about 12% in alkaline solution （pH 90） The higher the temperature， the worse the stability of febrifugine At 4080 ℃， the content of febrifugine was decreased to be 60% of its initial content in 10 hours， but the content was decreased by only 5% in 10 h at 20 ℃However， no matter 40 ℃or 60 ℃， febrifugine was mainly transformed into isofebrifugine， and the total content of febrifugine and isofebrifugine was equal to their initial total content in 10 hours， while incase of 80 ℃， the total content was decreased to be 8333% in 10 h， which suggested that the structure of febrifugine was absolutely changed， not just isomerized to be isofebrigugine at high temperature Light had a significant impact on the stability of febrifugine Under bright light， the content of febrifugine was reduced by about 23% in 108 h， but it only decreased by about 10% in the natural light or darkness In artificial gastric fluid （pH 14） and artificial intestinal fluid （pH 68）， the content of febrifugine was decreased by less than 5% in 10 h After storage at high temperature（60 ℃）， high humidity [（75±1）%] and strong light （3 000 lx） conditions for 10 d， the content of solid febrifugine was decreased by 027%， 76% and 539%， respectively The degradation of febrifugine basically complied with the firstorder reaction kinetic process in the following conditions： in water， methanol， 50%methanol and 10% acetonitrile solvents， alkaline solution （pH>7）， different light intensity and different temperatures （20，40 ℃）. Therefore， no matter the isolation and purification of febrifugine or the production of the related preparations， it should be done fast in the acidic solution， low temperature and dark conditions， while the febrifugine solid should be kept in dry and dark conditionsendprint
[Key words]febrifugine； stability； HPLC
常山碱是从中药常山Dichroa febrifuga Lour中别离制备出来的单体成分，是一种喹唑酮类生物碱，分子式C16H19O3N3，相对分子质量301。常山为虎耳草科植物常山D febrifuga的枯燥根，是我国闻名的截疟祛痰药，临床首要用于医治疟疾[1]。研讨发现常山中的常山碱（febrifugine）和异常山碱（isofebrifugine）是其抗疟的首要活性成分。常山碱和异常山碱性是一对同分异构体，在加热、酸、碱及不同溶剂中都易发作异构化改动[2]。可是，常山碱和异常山碱的活性却有很大不同，据文献报导[3]在鸡疟试验中，常山碱的抗疟活性约为奎宁的50倍，而异常山碱的抗疟活性约与奎宁适当。并且，近年来发现常山碱及其衍生物具有杰出的抗肿瘤、免疫增强、促进创伤愈合以及医治糖尿病、硬皮病等的效果[45]，这些研讨成果阐明常山碱具有宽广的使用远景。因而，确保常山碱的安稳性阻挠其发作转化关于常山碱的使用具有至关重要的含义。尽管20世纪50年代就别离得到常山碱单体，但有关其安稳性的研讨只在前期的文献[2]说到在必定条件下可与异常山碱发作互相转化，至今未见具体的文献报导。本文以克己常山碱样品为研讨目标，调查了常山碱在不同溶剂、不同pH溶液、不同温度、不同光照强度，及在人工胃液和人工肠液中的安稳性，还调查了常山碱固体在高温、高湿和强光下的安稳性，并经过研讨常山碱的安稳性，推导其降解动力学方程，研讨成果可为常山碱的制备及相关制剂的出产供给参阅。
1资料
11仪器
Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司），包含LPG3400剖析泵、WPS3000SL自动进样器、TCC300柱温箱和DAD3000二极管阵列检测器。Shimadzu LC20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司），包含LC20AT溶液传输单元、SIL20 A 自动进样器、SPDM20 A 二极管阵列检测器和LC solution色谱工作站。双压线性离子阱串联高分辩质谱OrbitrapVelos Pro（Thermo Fisher 公司），Ultimate 3000 超高效液相色谱仪（美国戴安公司）。布鲁克AⅢ 600 Ascend超导核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）。MettlerDSC 1 System差示扫描量热仪（瑞士）。XS105DU型1/10万天平（瑞士，梅特勒托利多公司），KQ250DB超声波清洗器（我国昆山市超声仪器有限公司），SevenEasy S20台式pH酸度计（上海，梅特勒托利多公司），YB2型澄明度检测仪（天津瑞来特仪器有限公司）和WDA药物安稳性检查仪（天津鑫洲科技有限公司）。
12试剂
甲醇和乙腈为HPLC级（美国Fisher公司），水为纯净水（屈臣氏集团香港有限公司），氨水、三乙胺、冰醋酸、氯化钠、磷酸二氢钾、柠檬酸和磷酸氢二钠均为剖析纯（国药集团化学试剂有限公司），胰酶（批号F20060707）和胃蛋白酶（批号20160706）均为生化试剂（北京奥博星生物技术有限责任公司）。
13对照品
常山堿对照品（批号151123，HPLC纯度≥98%）和异常山碱对照品（批号160114，HPLC纯度≥ 98%）均购自四川省维克奇生物科技有限公司。
2办法与成果
21克己常山碱样品纯度剖析
211常山碱的制备常山药材粗粉，20倍量90%乙醇浸泡3 d，过滤，滤液收回乙醇至无醇味，剩下水液用氨水调理pH至10左右，氯仿萃取3次，兼并氯仿萃取液，收回溶剂得浸膏。氯仿浸膏经重复硅胶柱色谱，氯仿甲醇（10∶0～9∶1）梯度洗脱，得常山碱粗品，无水乙醇重复重结晶，得常山碱。
212常山碱的结构判定白色针晶；mp：1854 ℃；HRESIMS m/z 302150 2 [M+H]+（核算值302149 9，C16H20O3N3）。氢谱和碳谱数据见表1，经与文献[6]对照，断定该化合物为常山碱。
214对照品溶液的制备取常山碱对照品2份，每份约10 mg，精细称定，加活动相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。取异常山碱对照品适量，精细称定，加活动相溶解制成每1 mL含103 mg的溶液，即得。
215供试品溶液的制备取常山碱样品3份，每份约10 mg，精细称定，加活动相溶解制成每1 mL含10 mg的溶液，即得。
216测定成果试验人员共选用2 种色谱仪进行纯度剖析试验。在上述色谱条件下，精细汲取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记载色谱图至主峰保存时刻至少3倍。在225 nm 下，除主峰外，可见杂质峰检出，按峰面积归一化法核算，纯度别离为9422%，9504%，9757%，9241%，9354%，9538%，均值（n=6）为9469%，RSD为19%。精细量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加活动相稀释至刻度，制成1%本身对照溶液。精细汲取1%本身对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记载色谱图。核算1%本身对照纯度别离为9391%，9493%，9877%，9061%，9210%，9488%，均值（n=6）为9420%，RSD为30%。
22常山碱保存率的核算
取常山碱对照品适量，精细称定，用活动相溶解制成质量浓度为106 mg·L-1的溶液，作规范曲线并核算回归方程为y=61048x+0331 7（R2 =0999 7）。用上述办法别离测定常山碱水溶液处理前和经各种处理后的质量浓度，核算常山碱的保存率。常山碱保存率=ρt/ρ0×100%，其间，ρt为处理后t时刻常山碱的质量浓度（g·L-1），ρ0为处理前常山碱的质量浓度（g·L-1）。endprint
23常山碱降解动力学研讨
对常山碱的安稳性研讨可看作常山碱在溶液中的降解反响，可表示为：A→B+C+D+X，即d[A]/dt=-K[A]n，当t=0 h时，[A]的质量浓度为ρ0，当t时，[A]的质量浓度为ρt；若按一级反响处理（n=1），则ρt=ρ0exp（-Kt），ln（ρt/ρ0 ） =-Kt，以 ln（ρt/ρ0 ）-t作图，若为线性，则证明反响为一级反响，该直线的斜率为速率常数K。若为一级反响，根据t1/2=0692/K，核算常山碱的半衰期。
若测定得到不同温度下的速率常数，可根据化学动力学中阿累尼乌斯经历公式[7]，K=Ae-Ea/RT，其对数方式为lgK=-Ea2303RT+lgA，活化能Ea的核算：lg（K2/K1）=-Ea2303R（1T2-1T1），核算活化能Ea。
24不同溶剂中常山碱的安稳性研讨
取常山碱样品5份，每份约10 mg，精细称定，置10 mL量瓶中，别离加入水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈和活动相溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含100 μg的样品溶液，常温（25 ℃）下别离于样品制备后第0，1，2，4，6，8，10，12，24 h进样，测定样品溶液中常山碱的质量浓度。成果见表2，3。
表2显现24 h后，常山碱在水、甲醇、50%甲醇、10%乙腈中都削减了约12%左右，而在活动相里却只削减了约1%，阐明常山碱在活动相中更安稳。表3成果阐明常山碱在水、50%甲醇、甲醇和10%乙腈中都根本契合一级反响（R2≥081，即相关系数r≥09），而其在活动相中的反响不属于一级反响。从半衰期上也可看出常山碱在活动相中最安稳，而在甲醇中降解最快。
25不同pH常山碱水溶液的安稳性研讨
取常山碱样品适量，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含308 μg的样品溶液。精细量取4份已配好的常山碱水溶液各1 mL，置10 mL棕色量瓶中，别离用pH为30（实测pH 279）、50（实测pH 554）、70（实测pH 724）和90（实测pH 875）的磷酸氢二钠（02 mol·L-1）柠檬酸（01 mol·L-1）缓冲溶液定容至刻度，摇匀，避光、室温下放置。别离于样品制备后第 0，2，4，6，8，10，12，24 h 取样，液相色谱条件下测定，记载不同pH下放置不同时刻后样品溶液中常山碱的质量浓度。成果见表4，5。
由表4能够看出常山碱在酸性和中性溶液更安稳。在酸性和中性环境中放置24 h后，常山碱的保存率都在98%以上；而在pH为875的碱性溶液中，室温避光放置24 h后常山碱相对含量降为开始的884%。表5显现在碱性溶液中，常山碱的降解根本契合一级反响，并且在碱性条件下常山碱降解最快。成果提示，在提取别离制备常山碱对照品或许制备常山碱制剂时要尽量在酸性和中性环境下进行。
26不同温度下常山碱水溶液的安稳性研讨
取常山碱样品适量，精细称定，置50 mL量瓶中，用水溶解并制成每1 mL含846 μg的样品溶液。取上述溶液分装在2 mL的棕色口服液瓶中，密封保存。在避光条件下将上述样品溶液别离置于20，40，60，80 ℃恒温水浴锅中，并别离于放置后第 0，2，4，6，8，10 h取样，敏捷冷却，HPLC测定不同温度下放置不同时刻后样品溶液中常山碱的质量浓度。成果见图2，表6～8。
表6和表8均显现在20～60 ℃内跟着温度的升高常山碱的降解速率逐步加快，在60 ℃时常山碱的降解最快，而在80 ℃时降解速率又低于60 ℃的降解速率。常山碱和异常山碱为同分异构体，或许在60 ℃时常山碱最易转化为异常山碱。由图2和表7可看出常山碱在加热进程中有部分转化为异常山碱，但跟着温度的升高，二者的总量在削减，阐明
跟着温度升高常山碱的结构发作了永久的改动，而不仅仅是转化为异常山碱的可逆性改动。表8显现，常山碱在20，40 ℃下降解反响根本契合一级反响，而60，80 ℃下不契合一级反响，温度升高常山碱敏捷转化或许降解。常山碱在水溶液中降解反响活化能Ea为3653 kJ·mol-1，一般化学反响活化能在40～100 kJ·mol-1，小于40 kJ·mol-1为快反响，常山碱在的水溶液中降解反响活化能Ea为3653 kJ·moL-1，为快反响，阐明温度对常山碱的安稳性影响较大。
27不同光照强度下常山碱水溶液的安稳性研讨
取常山碱样品适量，精细称定，用水溶解并定容至刻度，制成每1 mL含894 μg的样品溶液。从样品溶液中等量取3份，每份15 mL，置于25 mL量瓶中，密封备用。将上述3份样品溶液别离置于暗室、日光下和澄明度检测仪（光照强度3 000 lx）中，作为避光、天然光和强光照耀处理条件。在样品溶液放置后第0，12，24，36，72，84，96，108 h进样，测定样品溶液中常山碱的质量浓度。成果见图3，表9，10。
由表9可知，光照对常山碱水溶液的影响显着，强光照耀下常山碱水溶液的安稳性最差，108 h后常山碱损失率到达24%左右；避光和天然光下的差异不大，常山碱损失率在10%～14%。图3显现
强光条件下常山碱首要转化为异常山碱。表10显现，不管是强光、天然光仍是避光条件下，常山碱的降解都根本契合一级反响，由半衰期可看出，常山堿水溶液在避光条件下最安稳。以上成果提示常山碱在别离纯化进程中应尽量避光操作。
28人工胃液和人工肠液中常山碱的安稳性研讨
人工胃液的制备：取稀盐酸164 mL加水约800 mL及胃蛋白酶10 g，搅匀后加水定容至1 000 mL，即得。人工肠液的制备：取磷酸二氢钾68 g，加水500 mL使溶解，用01 mol·L-1氢氧化钠调理pH至68。取胰酶10 g，加水适量溶解；将两液混合后加水稀释至1 000 mL，即得。endprint
取常山碱样品适量，精细称定，别离加人工胃液和人工肠液溶解并定容，制成浓度别离为857，817 mg·L-1的人工胃液和常山碱人工肠液溶液。将上述2种溶液置于37 ℃水浴锅内，别离在制备后第0，2，4，6，8，10 h取样，HPLC检测，测定放置不同时刻后样品溶液中常山碱的质量浓度。成果见表11，12。
由表11可见常山碱在人工胃液（pH 14）和人工肠液（pH 68）中都比较安稳，常温放置10 h后常山碱较初始含量下降缺乏4%。表12显现在人工胃液和人工肠液中常山碱的降解均不契合一级反响。
29常山碱固体的安稳性研讨
291高温试验取常山碱样品适量，置于敞口的棕色称量瓶中放在药物安稳性检查仪（60 ℃）中，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量。
292高湿试验取常山碱样品适量，置于敞口的棕色称量瓶中放在枯燥器[底部放有NaCl饱和溶液，相对湿度为（75±1）%，25 ℃]里密闭保存，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量。
293强光照耀试验取常山碱样品适量，置于敞口的通明称量瓶中于澄明度检测仪（3 000 lx）下照耀，于第5天和第10天取样，测定常山碱含量，见表13。
由表13可知高温（60 ℃）对常山碱固体安稳性影响较小，在60 ℃下放置10 d常山碱含量简直无改变；高湿环境下，常山碱固体含量下降约7%，这除了有常山碱异构化为异常山碱的改动外还和固体吸湿导致含量下降有关；可是经强光照耀10 d后，常山碱含量下降约5%，阐明光照对常山碱固体有较大的影响。因而，常山碱固体应在避光、枯燥环境下储藏。
3评论
迄今为止，国内外学者现已对常山碱的别离纯化、结构润饰和药理活性进行了很多研讨，但对其安稳性的研讨却很少。本文经过选用高效液相色谱测定相对含量的办法，比较了不同溶剂、不同pH水溶液、不同温度和不同光照强度，以及人工胃液和人工肠液中常山碱的安稳性。成果表明，常山碱含量随光照强度、温度、溶液pH的升高而敏捷下降。相对而言，常山碱在酸性和中性环境中较安稳。人工胃液和人工肠液里常山碱都比较安稳，由于前者为酸性而后者为中性，这和前期发现的规则相吻合。影响要素试验是在比加快试验更剧烈的条件下进行，其意图是讨论药物的固有安稳性、了解影响其安稳性的要素及或许的降解途径与降解产品，为制剂出产工艺、包装、储存条件和树立降解产品剖析办法供给科学根据。本文根据2015年版《我国药典》中影响要素试验的要求，调查了常山碱固体在高温（60 ℃）、高湿[（75±1）%]和强光（3 000 lx）条件下的安稳性，成果发现高温下常山碱固体比较安稳，放置10 d后其含量根本没有改变；高湿条件下尽管常山碱含量下降7%左右，除了由于常山碱异构化为异常山碱外还和样品吸湿有关，还由于克己常山碱对照品较少因而并没有测定高湿前后样品中水分的含量，后续的试验中将会验证这一点；而在强光条件下，常山碱固体的外观尽管没有改变，但其含量显着下降，阐明光照对其安稳性有较大影响。以上成果提示常山碱的制备纯化和相关制剂的出产都应该在酸性或中性溶液中、避光、低温快速操作完结，而常山碱固体应在枯燥、避光条件下保存。
绝大多数单体成分在制备纯化和储藏加工进程中都会遭到各种要素的影响而降解，这些成分发作降解反响的动力学模型根本上契合零级或一级动力学反响模型。零级反响速度与反响物浓度无关，而受其他要素的影响，如反响物的溶解度或催化酶的浓度等，零级反响的半衰期与反响物开始浓度成正比。一级反响速率只与反响物浓度的一次方成正比，一级反响的半衰期与反响物开始浓度无关，是一个常数。本文测定了常山碱在不同条件下的化学动力学参数，成果发现其在常温下的多种溶剂（水、不同浓度甲醇和乙腈溶剂）中、碱性溶液（pH 875）、不同光照强度及不同温度（20，40 ℃）下的水溶液中的降解都根本契合化学动力学一级反响。可是温度再升高（60，80 ℃）时的降解反响并不契合一级反响。而药物的储藏和制备通常在低温（4 ℃）或常温（25 ℃）下进行，因而往后的试验中将考察常山碱在上述温度下的化学动力学，若其契合一级反响，则能够使用动力学模型别离猜测其在4，25 ℃下的半衰期及其架藏时刻（含量下降10%的时刻），相关成果将为常山碱类药物的研制供给根据。
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[責任修改孔晶晶]endprint