兰科药用植物大全 濒危兰科药用植物DNA条形码判定
汤欢+向丽+李西文+孙伟+王美娜+黄云峰+叶萌
[摘要] 兰科药用植物形状分类困难，此研讨选用DNA条形码分子判定法从分子水平验证兰科药用植物的传统形状分类。以matK，psbA-trnH和ITS2序列作为DNA条形码对已进行了形状判定的49属135种163份兰科药用植物样品进行分子判定，经DNA提取，PCR扩增、双向测序及校正拼接后，将得到的序列在GenBank中进行BLAST比对，然后运用MEGA 7.0软件中的Neighbor-joining （NJ）法构建物种系统进化树。成果表明，163份样品均能成功提取DNA；matK，psbA-trnH和ITS2序列的PCR扩增功率别离为100%，100%，98.77%；共取得487条序列，其间345条序列在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列，142条为新增序列；运用NJ法构建的兰科药用植物系统进化树中，根据matK序列所构建的物种系统进化树要优于根据psbA-trnH和ITS2序列所构建的系统进化树。matK，psbA-trnH和ITS2序列在判定兰科药用植物过程中互为弥补，DNA条形码分子判定法可用于辅佐兰科药用植物的分类判定。
[关键词] 兰科；DNA条形码；药用植物；分子判定
[Abstract] In this study，DNA barcoding was used to validate the traditional morphological classification of medicinal plants of Orchidaceae. The 163 samples of 135 species belong to 49 genera which have been confirmed by morphological identification were collected. Candidate sequences，including matK，psbA-trnH and ITS2 sequences，were amplified，bidirectionally sequenced，and assembled. All the sequences were blasted to GenBank database at NCBI，then analyzed using Neighbor-joining tree method by MEGA 7.0. The results showed that the DNAs of 163 samples were successfully extracted. The amplification efficiency of matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were 100%，100% and 98.77%，respectively. The 487 sequences were obtained，345 sequences of which have matched corresponding sequences in the GenBank database and 142 sequences were new sequences. The topology of NJ tree which were constructed with the matK sequences was better than the trees of psbA-trnH and ITS2 sequences. In conclusion，the matK，psbA-trnH and ITS2 sequences were complementary and suitable for identification of medicinal plants of Orchidaceae. DNA barcoding can be used as an auxiliary means for identification of medicinal plants of Orchidaceae.
[Key words] Orchidaceae；DNA barcoding；medicinal plants；molecular identification
兰科Orchidaceae是国际性大科之一，包含地生、附生、菌类寄生等生活方式[1]，在全国际约有800属20 000～35 000种[2-4]，Flora of China中记载我国境内的野生兰科植物共有194属（我国特有属11个） 1 388种（我国特有种491个）[4]。兰科植物中的许多物种因其形状高度进化，物种之间仅有极纤细的差异，从形状上对其进行判定较困难。
自双名法树立以来的250多年里，人类共判定和描绘了约170万种生物[5]，但这只是占到分类学家估计物种数量的15%[6]。DNA条形码（DNA barcoding）是一种根据DNA序列进行生物物种判定的技能，即运用规范化的一个或许几个DNA片段进行序列剖析，根据核苷酸序列差异，对物种进行快速和精确的判定[7-9]。传统物种分类学首要根据物种形状和解剖特色进行判定，受判定人员的常识结构、经历以及物种生长发育状况等要素的影响[10]。DNA条形码分子判定法因是从分子水平对物种进行判定，突破了对经历的过度依靠，而且不受样品形状和取样部位的约束，判定稳定性和重复性高，操作簡单，便于短少分类学常识的人员进行物种判定，能极大缓解当时分类人才缺少的现状。DNA条形码分子判定法经过构建系统进化树，可加快隐存种和新物种的发现。经过信息渠道树立物种DNA条形码数据库，易于完成数字化，完成资源共享[11-15]。现在，DNA条形码分子判定法已在多种类型的药用植物判定中得到了广泛应用，表现出较强的判定才能[16-22]。
在悠长的中医药开展过程中，劳动人民很早就运用一些兰科植物进行看病，在我国现存最早的药学专著《神农本草经》中就以赤箭、石斛、白芨之名记载了3种兰科植物。传统中医以为许多兰科药用植物具有生津止渴、润肺化痰、清热解毒、活血调经、软坚散结、祛风止痛、止血、定惊、敛疮等成效。兰科药用植物的药用部位一般为其全草、块茎或假鳞茎，一些常用物种，如天麻、石斛、白及、山慈菇等，均具有较高药用价值？因为兰科药用植物形状分类较困难，很简单收集到形状附近的伪品而要挟到用药安全。因而，此研讨运用DNA条形码分子判定法对兰科药用植物进行判定研讨，挑选合适兰科药用植物分子判定的DNA条形码序列，评论其在判定兰科药用植物上的可行性，从分子水平验证兰科药用植物的传统形状分类成果，确保用药安全。
1 资料
1.1 收集与判定
查阅我国数字植物标本馆（Chinese Virtual Herbarium，CVH，http：//www.cvh.org.cn/）和相关文献，并根据实际状况断定采样区域和采样道路。采样时，根据CVH中的标本信息，在兰科药用植物散布较会集的区域进行要点查询收集。收集地首要包含：广西壮族自治区百色市境内的那坡县山君跳自然保护区和乐业-凤山国际地质公园以及广东省深圳市梧桐山脚下的“深圳市兰科植物保护研讨中心”。共收集了49属135种163份兰科药用植物，经过“深圳市兰科植物保护研讨中心”饶文辉馆长和广西中医药研讨院黄云峰副研讨员等兰科专家判定。
1.2 采样区域概略
那坡县山君跳自然保护区坐落广西西南部的百色市那坡县，与云南东南部、越南北部相邻。该区域地理坐标为东经105°31′—105°53′ E，北纬22°56′—23°15′ N，最高峰海拔1 603 m；多年均匀日照1 404 h，年均温18.8 ℃，≥10 ℃的活动积温6 026 ℃，无霜期324 d；多年均匀降水量1 408 mm，蒸发量1 388 mm；土壤首要为红壤、黄红壤、黄壤、石灰土等；气候温文、雨热充沛，植被保存较好，属北热带气候带，地带性植被型以沟谷雨林和石灰岩山地季雨林为主，是中越边境植物多样性中心区域，兰科植物尤为丰厚。广西乐业-凤山国际地质公园坐落云贵高原向广西盆地过渡的斜坡地带，由相邻的乐业大石围国家地质公园和凤山岩溶国家地质公园组成，该区域地理坐标为东经106°18′—107°06′ E，北纬24°18′—24°50′ N，海拔274～1 500 m，属亚热带气候，热量充沛，干湿季显着，每年5—10月为旱季，11月至次年4月为旱季；该区域土壤多为由砂页岩风化的残积母质发育而成的红壤、黄壤和低海拔的褐红壤，部分有石灰土。广东省深圳市梧桐山脚下的“深圳市兰科植物保护研讨中心”保存着我国近千种原生兰科植物资源，被誉为“我国兰谷”，该中心所在区域属南亚热带气候。
2 办法
2.1 DNA提取、PCR扩增和测序
2.1.1 DNA提取 用75%乙醇擦洗经50 ℃低温干燥的叶片样品，称取约30 mg，经恰当剪切后，将样品移入已灭菌的2 mL圆底EP管中，并向EP管中参加一颗小钢珠，再放入高通量安排研磨仪（Sceintz Biotech Co.，China）中，在50 Hz频率下研磨120 s后，参加核别离液（配方为：Tris-HCl （pH 8.0）终浓度100 mmol·L-1，EDTA （pH 8.0）终浓度20 mmol·L-1，NaCl终浓度0.7 mol·L-1，PVP-40为2%，以上各物质配成溶液后灭菌，运用之前参加0.4%的β-巯基乙醇）[23]清洗1至屡次（800 μL/次）至上清液无色后，用移液枪吸去上清液，留沉积，再向其间参加裂解液，混匀后，运用56 ℃水浴过夜（8～12 h） （关于新鲜样品或较易提取出DNA的样品，可置于65 ℃水浴锅中水浴60～90 min），再选用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取兰科药用植物样品总基因组DNA。具体操作过程拜见中药材DNA条形码分子判定辅导准则及试剂盒说明书。
2.1.2 PCR扩增和测序 经过查阅相关文献[24-31]，挑选在兰科药用植物中运用较广泛的叶绿体基因组matK序列和psbA-trnH序列以及核基因组ITS2序列作为DNA条形码序列。扩增引物及PCR扩增程序详见相关文献[23]。选用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增状况，对呈现明晰意图条带的样品进行纯化后，运用ABI 3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.，USA）进行双向测序。
2.2 数据处理
运用CodonCode Aligner V6.0.2 （CodonCode Co.，USA）软件对测序取得的序列进行质量剖析和校正拼接，去除低質量区和引物区，取得了ITS2，psbA-trnH，matK这3种DNA条形码序列。再运用MEGA 7.0 （Molecular Evolutionary Genetics Analysis，USA）软件对候选条形码序列进行序列剖析，用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统进化树，并用自举查验法Bootstrap 1 000次查验各分支的支持率[32]。
3 成果与剖析
3.1 DNA提取及PCR扩增
将163份兰科药用植物样品用核别离液洗后，参加裂解液，用56 ℃水浴过夜（8～12 h），以确保样品中的DNA可以充沛溶出，进步DNA提取的成功率。之后，严厉依照DNA提取试剂盒的操作过程进行操作。163份兰科药用植物样品DNA均成功提取。PCR扩增后，样品经琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。163条matK序列和psbA-trnH序列全扩增成功，ITS2序列扩增出161条（2条未出），扩增成功率98.77% （表1）。扩增成功的样品均有较显着的单一意图条带。经双向测序和校正拼接后，共得到487条DNA条形码序列。
3.2 BLAST剖析
对得到的487条序列在GenBank数据库中运用BLAST办法进行序列比对。此研讨取得的序列中，有345条在GenBank数据库中比对到了相应物种的序列，其间，在matK序列中有61条的BLAST比对率为100%，62条的BLAST比对率为99%，2条的BLAST比对率为98%，1条的BLAST比对率为97%；psbA-trnH序列中有23条的BLAST比对率为100%，46条的BLAST比对率为99%，21条的BLAST比对率小于99%；ITS2序列中有72条的BLAST比对率为100%，34条的BLAST比对率为99%，23条的BLAST比对率小于99%。别的，此研讨中共有142条DNA条形码序列（别离为37条matK序列，73条psbA-trnH序列和32条ITS2序列）在GenBank数据库中比对不到相应的序列，这些DNA条形码序列作为新增条形码，将进一步完善数据库（表2）。
3.3 NJ树剖析
选用Bootstrap 1 000次重复，仅显现自展支持率≥50%的数值。
将135种兰科药用植物的163条matK、163条psbA-trnH和161条ITS2序列别离运用NJ法构建系统进化树（图2）。matK，psbA-trnH，ITS2这3种序列的兰科药用植物NJ树中，各属物种均别离聚成一支，各物种的多条序列也别离聚成一支，3种序列彼此弥补，可以很好地将此研讨中所做的兰科药用植物各物种区分隔。其间matK序列构建的NJ树中各亚族可以很明晰地被分隔，白及亚族与笋兰亚族及贝母兰亚族聚成一支，树兰族的香荚兰亚族没有和其他树兰族的物种聚成一支，柄唇兰亚族与毛兰亚族聚成一支，鸟巢兰族各亚族聚成一支，杓兰亚科各物种聚成一支。psbA-trnH序列构建的NJ树中各亚族可以很明晰地被分隔，但杓兰亚科的物种没有聚成一支，毛兰亚族各属聚成了2支，鸟巢兰族各亚族聚成一支。ITS2序列构建的NJ树中各亚族可以很明晰地被分隔，白及亚族与笋兰亚族及贝母兰亚族聚成一支，毛兰亚族与柄唇兰亚族各聚成一支，但树兰族的各亚族被分成了2部分，鸟巢兰族各亚族聚成一支，杓兰亚科各物种聚成一支。
4 成果与评论
此研讨挑选在兰科植物中运用较广泛的matK，psbA-trnH，ITS2这3种条形码序列作为兰科药用植物分子判定的DNA条形码序列。此研讨中163份兰科药用植物样品均在提取DNA前，运用核别离液进行了一至屡次洗刷，以加大所提DNA的纯度和浓度。PCR反响系统为25 μL，当运用2.5 μmol·L-1的引物各1 μL时扩增作用较好，而引物浓度过高时，比较简单呈现非特异性扩增反响，简单发生引物二聚体，下降功率，而引物浓度过低时，会使扩增产品过少而影响后续试验。PCR循环的次数首要取决于开始模板DNA的浓度，因为循环反响的次数越多，反响中发生非特异性产品的量越大，因而，在满意产品得率的前提下，应尽量削减循环次数，此研讨中设置的PCR循环次数为35～40次，所得到的PCR产值均能满意后续试验要求。
我国学者树立了以ITS2序列为主，psbA-trnH序列为辅的药用植物类中药材DNA条形码判定系统[33-35]。经过运用matK，ITS2和psbA-trnH这3种DNA条形码序列对135种163份兰科药用植物样品进行DNA条形码分子判定后发现matK序列较ITS2序列和psbA-trnH序列更适合用于判定此研讨中的兰科药用植物。Lahaye等[24]剖析了以兰科为主的1 600份植物的DNA序列，发现独自运用matK序列的判定功率可到达90%以上。此研讨的研讨成果与Lahaye等的研讨成果相符，这可能是因为
matK序列为叶绿体基因组序列，比较适合判定兰科等单子叶植物，而ITS2为核基因组序列，在双子叶植物中有比较好的判定功率。因为兰科药用植物样品收集较困难，此研讨所收集的兰科药用植物样品份数较少，上述发现还有待更深化的研讨。因为所收集的每个物种仅有1～3份样品，这会导致对物种内变异的轻视，或许没有剖析姊妹类群而高估种间差异，使DNA条形码剖析成果中的DNA条形码判定有用性和精确率偏高，在往后还应进一步扩展物种量和样品量，持续进行更深化的研讨。
因为亚种、变种等种下等级以及某些属内物种，其DNA序列的差异较小，即便一起运用多段DNA条形码序列也很难对其进行有用判定，如在此研讨中的石斛属样品，虽然一起运用了3种DNA条形码序列对其进行判定，依然有一些物种不能分隔。因而，很有必要在往后持续探究通用DNA条形码序列，并探究专门用于某些物种的特异DNA条形码序列，进一步改进相关的DNA提取办法和提取试剂，不断完善此分子判定法，逐渐处理对种下居群判定困难等问题，并加快对兰科物种的大规模测序，完善兰科植物DNA条形码数据库，为往后更高效快捷地运用此DNA条形码分子判定法判定兰科植物供给参阅序列，活跃推动兰科植物判定和系统进化研讨。
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[责任编辑 吕冬梅]