脑缺血打丹参酮和天麻有作用丹参酮ⅡA对H9c2心肌细胞缺血再灌注损害的维护机制

点击：0时间：2024-09-01 09:55:30

吴爱萍等

[摘要] 意图调查丹参酮IIA对心肌缺血再灌注损害的维护效果及相关信号传导通路。办法经过树立H9c2心肌细胞缺血再灌注模型，别离参加不同浓度丹参酮IIA，选用CCK-8检测细胞存活率，经过流式细胞术检测细胞凋亡率；别的分为丹参酮IIA组、AG490组、丹参酮IIA及AG490组，经过Western blot办法检测JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。成果 CCK-8检测显现模型组细胞存活率为78.90%±5.163%，与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；丹参酮IIA 2.5 μM组细胞存活率为85.76%±6.101%，与模型组比较，P>0.05；丹参酮IIA 10 μM组细胞存活率为90.62%±2.321%，与模型组比较，P<0.05；丹参酮IIA 40 μM组细胞存活率为86.38%±4.712%，与模型组比，P<0.05；流式细胞术检测显现参加丹参酮IIA缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡数削减；丹参酮IIA组P-JAK2、P-STAT3蛋白表达较缺血再灌注组显着上升，而AG490组的P-JAK2蛋白表达显着下调。定论丹参酮ⅡA可改进缺血再灌注引起的大鼠心肌细胞凋亡，其维护机制或许与JAK2/STAT3信号通路有关。

[关键词] 丹参酮IIA； H9c2心肌细胞；缺血再灌注； JAK2/STAT3信号通路

[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）33-0001-03

[Abstract] Objective To study the protective effect of tanshinone IIA on myocardial ischemia-reperfution（I/R） injury and related signialing pathway. Methods Made H9c2 myocytes I/R models， add different concentrations of tanshinone IIA after 24 hours， then test apoptosis rate by cck-8 and flow cytometry. Add tanshinone IIA， AG490， tanshinone IIA+AG490 respectively， then assay the expression of JAK2， P-JAK2， STAT3， P-STAT3 by western blot. Results CCK-8 tests showed the cell survival rate of model group was 78.90%±5.163%， compared with the control group had statistical differences. Compared with the model group， the cell survival rate increased to 85.76%±6.101% at the tanshinone IIA concentration of 2.5 μM（P>0.05）， increased to 90.62%±2.321% at the tanshinone IIA concentration of 10 μM （P<0.05）， and increased to 86.38%±4.712% at the tanshinone IIA concentration of 40 μM （P<0.05）. Flow cytometry analysis also displayed tanshinone IIA could decrease the number of myocardial apoptosis which caused by I/R injury. The expression of P-JAK2 and P-STAT3 increased in tanshinone IIA group compared to I/R group. The expression of P-JAK2 reduced in AG490 group. Conclusion Tanshinone IIA can reduce I/R induced myocardial apoptosis， and the protective mechanism may be related to the JAK2-STAT3 signaling pathway.

[Key words] Tanshinone IIA； H9c2 cells； Ischemia-reperfusion； JAK2-STAT3 signaling pathway

跟着人口的老龄化，缺血性心脏病（尤其是冠心病）发病率逐年升高，是当今世界尤其是开展中国家致死率最高的疾病[1]。心肌缺血疾病医治的根本措施在于及时、有用的康复缺血心肌的灌注，但是心肌缺血必定时刻再康复血流供给后，心肌细胞功用代谢妨碍及结构损坏可呈现未减轻反而加剧的状况，即心肌缺血再灌注损害。现在急诊溶栓、经皮冠状动脉内成形术等再灌注医治广泛开展，缺血再灌注损害成为阻止缺血心肌从再灌注医治中取得最佳效果的临床亟待解决的难题。

丹参酮ⅡA 是从丹参中提取的一种脂溶性成分，具有抗缺氧、改进微循环、改进血液流变学特性、舒张冠状动脉、减轻心肌缺血等多种药理效果，现在已有研讨证明丹参酮IIA预处理可减轻心肌缺血再灌注损害[2]。心肌缺血再灌注损害时，多种细胞外信号被激活，均可经过Janus激酶/信号转导和转录激活子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路发挥效果，改动心肌缺血再灌注损害的发作、开展和转归。JAK2/STAT3作为JAK/STAT的重要亚型，在心肌缺血再灌注损害维护机制中具有核心效果。本试验经过树立H9c2心肌细胞缺血再灌注损害模型，进一步研讨丹参酮IIA对心肌缺血再灌注损害的维护机制，评论其与JAK2/STAT3途径相关机制，为心肌缺血再灌注损害的医治供给新的根据。

1材料与办法

1.1 细胞株与首要试剂

H9c2大鼠心肌细胞株来自美国ATCC，在含10%胎牛血清的高糖DMEM彻底培育基内，5%CO2、37℃培育。JAK2激酶按捺剂（AG490，Calbiochem公司，美国）；丹参酮IIA（雅安三九药业有限公司供给，批号981011）。

1.2 心肌缺血再灌注模型树立及分组

按文献[3]办法对H9c2细胞进行缺血再灌注处理。制造正常台氏液：140 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L HEPES，5.8 mmol/L葡萄糖，pH 7.4。制造缺血台氏液：140 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，1mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L HEPES，10 mmol/L D-2-脱氧葡萄糖，10 mmol/L Na2S2O4，pH 7.4。对数生长期细胞，去除培育基，PBS洗刷后，参加正常台氏液预培育1 h后制备缺血再灌注模型，参加缺血台氏液培育24 h。试验分为对照组、缺血再灌注组、丹参酮IIA组、AG490组及丹参酮IIA+AG490组。

1.3试验办法及调查目标

①细胞损害的测定：选用CCK-8法测定细胞存活率，H9c2细胞参加缺血台氏液培育24 h后别离参加丹参酮IIA 2.5 μM，10 μM，40 μM，依照密度为2×104/孔接种至96孔板，于37℃孵育3 h后，经过酶标仪于450 nm波长下行吸光度值测定。对照组细胞存活率设定为100%，细胞存活率=试验组/对照组×100%。H9c2细胞参加缺血台氏液培育24 h后试验组别离参加丹参酮IIA 2.5 μM，10 μM，40 μM，经过流式细胞术检测细胞凋亡率。②H9c2细胞参加缺血台氏液培育24 h后别离参加丹参酮IIA 10 μM，AG490 50 μM，丹参酮IIA 10 μM及AG490 50 μM，经过westernblot办法检测JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。

1.4 统计学办法

选用SPSS 18.0统计学软件，计量材料以（x±s）标明，组间比较选用独立样本t查验，P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 丹参酮ⅡA按捺心肌缺血再灌注形成的细胞凋亡

2.1.1 不同浓度丹参酮IIA对细胞存活率的影响 CCK-8检测显现模型组细胞存活率为（78.90±5.163）%，与对照组比较具有统计学含义（t=-9.138，P=0.001）；丹参酮IIA 2.5 μM组细胞存活率为（85.76±6.101）%，与模型组比较无统计学含义（t=1.919，P=0.091）；丹参酮IIA 10 μM组细胞存活率为（90.62±2.321）%，与模型组比较具有统计学含义（t=4.629，P=0.002）；丹参酮IIA 40 μM组细胞存活率为（86.38±4.712）%，与模型组比较具有统计学含义（t=2.393，P=0.044）。见图1。

3 评论

心肌缺血再灌注损害是冠状动脉内溶栓、冠脉搭桥以及介入医治中常见的严峻并发症，现在仍缺少有用防治办法，怎么减轻心肌缺血再灌注损害已经成为缺血性心脏病研讨的一大热门[4]。近年来中药减轻心肌缺血再灌注损害的试验研讨取得了较大开展，丹参酮ⅡA是一种从丹参中提取的脂溶性物质，具有用果广泛、副效果小和价格低一级长处，现在临床上已用于医治冠心病、心绞痛等。既往研讨显现丹参酮ⅡA对大鼠缺血性脑损害具有维护效果[5]。丹参酮ⅡA对心肌缺血再灌注损害是否具有维护效果及其效果机制仍缺少相关研讨。

本研讨经过H9c2细胞体外培育并树立缺血再灌注模型从细胞水平进行研讨，调查丹参酮ⅡA对缺血再灌注后心肌的维护效果。CCK-8及流式细胞术检测均显现，丹参酮ⅡA组相对于缺血再灌注组凋亡心肌细胞数量显着削减，提示丹参酮ⅡA对缺血再灌注心肌具有维护效果，别的维护效果具剂量依赖性，CCK-8成果提示丹参酮IIA 10 μM组存活细胞数量添加显着。

Janus激酶/信号转导和转录激活子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）通路作为细胞因子信号传导的重要途径，广泛参加细胞的增殖、分解、凋亡等多种生理、病理进程[6]，参加改动心肌缺血再灌注损害的发作、开展和转归[7]。研讨证明，前期的再灌注损害、钙超载引起线体通透性转化孔过度敞开，导致线粒体肿胀、外膜决裂，开释凋亡诱导因子和细胞色素 C，诱导细胞凋亡分子的上调，发动细胞的凋亡和逝世级联反响[8-10]。JAK/STAT信号通路的激活可以按捺凋亡，维护心肌细胞，而JAK2/STAT3是JAK/STAT通路中的重要成员之一，在心肌缺血再灌注损害维护机制中具有核心效果[11-13]。

AG490是JAK2的特异性按捺剂，阻断JAK2 及下流蛋白STAT3的磷酸化。本研讨发现，与缺血再灌注组比较，丹参酮ⅡA组能显着诱导JAK2磷酸化表达添加，而AG490显着削弱丹参酮ⅡA组所诱导的JAK2磷酸化，提示丹参酮ⅡA的心肌维护效果或许是经过激活JAK2通路，进一步调理凋亡相关蛋白的表达，削减心肌细胞凋亡，使缺血再灌注形成的损害得到缓解。

本试验仍存在缺乏，仅经过H9c2心肌细胞体外培育在细胞水平进行研讨，丹参酮ⅡA在动物水平是否具有减轻缺血再灌注损害效果及其机制仍待进一步研讨。经过本试验开始标明丹参酮ⅡA可下降H9c2心肌细胞缺血再灌注引起的细胞凋亡，其维护机制或许与JAK2/STAT3信号通路有关，丹参酮ⅡA或许成为医治缺血性心肌病的重要挑选。

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（收稿日期：2014-09-19）