丹参酮 UPLC—MS/MS测定复方丹参方中丹参酮ⅡA、丹参酚酸B、人参皂苷Rg1及其在大鼠血浆和脑安排的药代动力学研讨

张杰+刘胜兰+王慧+阳国平+李劲平+刘世坤+唐智+裴奇+黄攀豪

[摘要]树立大鼠血漿和脑安排中丹参酮Ⅱ_a（TSⅡ_a）、丹酚酸B（SAB）、人参皂苷Rg₁（GRg₁）的UPLC-MS/MS剖析办法，并展开药物动力学研讨。选用SD大鼠，单剂量灌胃（ig）复方丹参方，收集血液与脑安排样品，选用UPLC-MS/MS测定血浆和脑安排中TSⅡ_a、SAB和GRg₁的浓度，以Phoenix WinNolin 6.1药动学程序软件对数据进行非房室模型拟合，选用核算矩法核算药动学参数。经办法学考证，3种成分的峰面积与其在血样及脑安排中的浓度线性关系杰出（r>0.992 2）；回收率为58.86%～112.1%，日内、日间RSD≤9.7%，精确度及安稳性均契合体内药物剖析的要求。大鼠ig给复方丹参方后的血浆药动参数如下：丹参酮Ⅱ_atmax（1.58±0.081） h，Cmax（725.4±88.20） μg·L^-1，AUC0-t（2 101.3±124.85） μg·h·L^-1， MRT0-t（3.66±0.05） h；丹酚酸B tmax（1.29±0.21） h，Cmax（307.9±46.75） μg·L^-1，AUC0-t（537.4±88.24） μg·h·L^-1， MRTlast （2.08±0.11） h；人参皂苷Rg₁tmax（1.42±0.20） h，Cmax（460.38±154.60） μg·L^-1，AUC0-t（383.4±88.16） μg·h·L^-1， MRTlast （1.87±0.046） h。脑安排药动参数如下：丹参酮ⅡA tmax（0.75±0.22） h，Cmax（1.41±0.420） ng·g^-1，AUC0-t（4.34±2.48） ng·h·g^-1， MRT0-t （4.00±1.90） h；丹酚酸B tmax（1.08±0.20） h，Cmax（21.09±4.850） ng·g^-1，AUC0-t（14.83±3.160） ng·h·g^-1， MRT0-t（0.99±0.08） h；人参皂苷Rg₁tmax（0.50±0.16） h，Cmax（130.96±54.220） ng·g^-1，AUC0-t（136.24±34.350） ng·h·g^-1， MRT0-t（2.87±0.33） h。该研讨所树立的UPLC-MS/MS办法可用于大鼠血浆及脑安排中丹参酮Ⅱ_a、丹酚酸B、人参皂苷Rg₁中的药动学研讨。

[关键词]UPLC-MS/MS； 丹参酮Ⅱ_a； 丹酚酸B； 人参皂苷Rg₁； 药动学

[Abstract]A sensitive and specific ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for analysis of tanshinone Ⅱ_a（TSⅡ_a）， salvianolic acid B（SAB） and ginsenoside Rg₁（GRg₁） in rat plasma and brain tissues. Male healthy Sprague-Dawley（SD） rats were orally given single dose of Fufang Danshen preparation （TS Ⅱ_a 60 mg·kg^-1， SAB 300 mg·kg^-1， GRg₁ 150 mg·kg^-1， borneol 300 mg·kg^-1）， and their blood samples and brain tissues were collected at different time points. The drug plasma and brain tissue concentrations of the three analytes were determined by UPLC-MS/MS method. Subsequently， the main pharmacokinetics parameters of plasma and brain tissues were calculated by using Phoenix WinNolin 6.1 software. The methodological test showed that all of analytes in both plasma and brain homogenate exhibited a good linearity within the concentration range（r>0.992 2）. Their mean recoveries were between 58.86% and 112.1%. Intra-day and inter-day precisions of the investigated components exhibited RSD≤9.7%， and the accuracy（RE） ranged from -9.68% to 8.20% at all quality control levels. The results of accuracy and stability meet the requirements for biopharmaceutical analysis. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.58±0.081） h， （725.4±88.20） μg·L^-1， （2 101.3±124.85） μg·h·L^-1 and （3.66±0.05） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.29±0.21） h， （307.9±46.75） μg·L^-1， （537.4±88.24） μg·h·L^-1 and （2.08±0.11） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.42±0.20） h， （460.38±154.60） μg·L^-1， （383.4±88.16） μg·h·L^-1 and （1.87±0.046） h， respectively. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the brain tissue were （0.75±0.22） h， （1.41±0.42） ng·g^-1， （4.34±2.48） ng·h·g^-1 and （4.00±1.90） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.08±0.20） h， （21.09±4.850） ng·g^-1， （14.83±3.160） ng·h·g^-1 and （0.99±0.08） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （0.50±0.16） h， （130.96±54.220） ng·g^-1， （136.24±34.350） ng·h·g^-1 and （2.87±0.33） h， respectively. The developed method was successfully applied in pharmacokinetic studies on content of TS Ⅱ_a， SAB and GRg1 in rat plasma and brain tissues.

[Key words]UPLC-MS/MS； tanshinone Ⅱ_a； salvianolic acid B； ginsenoside Rg₁； pharmacokinetic

复方丹参方由丹参、三七和龙脑3味中药组成，活血化瘀，理气止痛，被广泛用于冠心病、心复疼痛、脑缺血再灌注损害、脑缺血、阿尔兹海默病等^[1-3]，效果切当，《我国药典》1977年版至2015年版均有收载，且已列入国家根本药品目录。研讨标明，丹参首要有效成分为丹参酮Ⅱ_a、隐丹参酮等脂溶性丹参酮类和丹参酚酸B、丹参素等水溶性丹参酚酸类，对心肌缺血、脑缺血以及脑缺血再灌注损害具有显着的维护效果^[4]。三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁和Rb₁等三七皂苷类是三七的首要有效成分，具有改进微循环、抗血栓构成和扩张血管等效果^[5]。龙脑为佐使药，芳香走窜，“引药上行”。

近年来，有关复方丹参方药理药效、药代动力学、剂型、质量操控等研讨报导较多。在药代动力学范畴，大多局限于丹参、三七独自或联合给药后大鼠血浆药动学行为研讨，或打针单体后于某一时刻点在大鼠脑安排中的散布状况研讨^[6-9]。本研讨选用UPLC-MS/MS技能，树立了复方丹参方中首要有效成分丹参酮Ⅱ_a、丹参酚酸B、人参皂苷Rg₁在大鼠血浆和脑安排中定量剖析办法，并运用此剖析办法对大鼠血浆及脑安排中的药动学特征进行了研讨，为进一步展开复方丹参方配伍规则、临床运用研讨奠定根底。

1 资料

Waters Xevo TQ-S型三重四极杆液质联用仪，包含Waters Acquity I 型 UPLC液相色谱仪带自动进样器和柱温箱，带电喷雾离子化源（ESI）和MassLynx V4.1软件数据处理系统（Waters，美国）；METTLER TOLEDO MS105DU型1/10万天平（METTLER，美国）；VORTEX-6旋涡混合器（江苏海门其林贝尔仪器制作有限公司）；VIBRAX VXR 振荡器（德国IKA公司）；Eppendorf Centrifuge 5415型冷冻高速离心机（德国）；吉尔森移液器；ND100-1 氮气吹扫仪（杭州瑞诚仪器有限公司）。

丹参酮Ⅱ_a（TSⅡ_a，纯度99.08%，批号Must-15081916）、丹酚酸B（SAB，纯度99.08%，批号Must-15092512）、人参皂苷Rg₁（GRg₁，纯度98.10%，批号Must-15042215）对照品购自成都曼斯特生物科技有限公司；多潘立酮对照品（批号100304-201103）和雙氯酚酸钠对照品（批号100334-200302）购自我国食品药品检定研讨院；三七总皂苷（批号Must-15060601，人参皂苷Rg₁的质量分数为44.8%）；龙脑（湖南科瑞鸿泰股份有限公司）和丹参（湖南崇善堂中药饮片有限公司）经中南大学药学院李劲平副教授判定均契合药典规则；丹参煎液的制备：取丹参饮片300 g，按2015年版《我国药典》中复方丹参片中丹参的提取工艺进行提取，并浓缩至200 mL。用HPLC测定丹参煎液中TSⅡ_a 6 g·L^-1，SAB 30 g·L^-1。甲醇、乙腈（色谱纯，Merck）；甲酸（色谱纯，ACS）；水（娃哈哈纯净水）；其他为剖析纯试剂。

SPF级SD雄性大鼠66只，体重（220±20） g，由中南大学湘雅三医院动物试验中心供给，合格证号SCXK（湘）2014-0016。

2 办法

2.1 给药与样品收集

大鼠适应性喂食1周后，试验前12 h 禁食不由水，并随机分为11组，每组6只，各组大鼠均按丹参15 g·kg^-1（TSⅡ_a 60 mg·kg^-1，SAB 300 mg·kg^-1），三七5 g·kg^-1（GRg1 150 mg·kg^-1），龙脑300 mg·kg^-1ig给药。于给药前和给药后15，30，45 min 和1，1.5，2，4，6，8，10 h 去除眼球采血，肝素抗凝。并立即在冰台上快速取大鼠脑安排，剥离软脑膜，生理盐水洗净，滤纸吸干外表水分，称重，以生理盐水为匀浆液，按1 mL生理盐水含0.45 g脑安排进行匀浆，将血浆以及脑安排匀浆样品均放置于-20 ℃冰箱保存。

2.2 样品处理

2.2.1 血浆中TSⅡ_a，GRg₁测定样品处理 精细汲取100 μL血浆，精细参加15 μL 多潘立酮（20 μg·L^-1）混匀，参加300 μL乙腈，于震动器上震动10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1离心8 min，汲取上清液100 μL置于新EP管中，参加200 μL水，涡旋混匀，取10 μL进样检测。

2.2.2 脑安排TSⅡ_a，GRg₁测定样品处理 精细汲取100 μL脑安排匀浆，精细参加5 μL 多潘立酮溶液（20 μg·L^-1）混匀，参加150 μL乙腈，于震动器上震动10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1离心8 min，汲取上清液100 μL置于新EP管中，参加150 μL水，涡旋混匀，取10 μL进样检测。

2.2.3 血浆及脑安排中SAB测定样品处理 精细汲取200 μL血浆或脑安排匀浆，精细参加10 μL双氯芬酸钠溶液（1 mg·L^-1）混匀，参加80 μL HCl溶液（1 mol·mL^-1）混匀，再以2 mL乙酸乙酯震动（1 500 r·min^-1）提取10 min，汲取上清，于40 ℃下N₂吹干，150 μL 50%乙腈溶液复溶，13 200 r·min^-1离心8 min，取上清10 μL进样检测。

2.3 测定条件

2.3.1 色谱条件 别离树立测定血浆与脑安排样品中TSⅡ_a，GRg₁，SAB浓度的色谱条件。色谱柱ACQUITY UPLCTM BEH 苯基柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），活动相A为乙腈（含0.1%甲酸），B为0.25%甲酸水，柱温为35 ℃，进样体积10 μL。TSⅡ_a，GRg₁和内标多潘立酮的梯度洗脱程序为0～3 min，24% A，3～4 min，24%～85% A，4～6 min，85%A，6～7 min，24% A，流速0.2 mL·min^-1。SAB和内标双氯芬酸钠梯度洗脱程序为0～1.8 min，35%A，1.8～4 min，35%～60%A，4～5 min，60%～35%A，流速为0.25 mL·min^-1。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），别离以正、负离子形式检测。正离子形式检测TSⅡ_a，GRg₁和多潘立酮，负离子形式检测SAB和双氯芬酸钠。作业参数设置为：离子源温度500 ℃，喷雾电压3.0 kV，雾化氣N₂的流速为1 000 L·h^-1，磕碰气氩气的流速为0.12 mL·min^-1。扫描办法为多反响检测（MRM），检测以下离子反响m/z 295/249.3（TSⅡ_a），磕碰能量为20 V；m/z 823.09/643.17（GRg₁），磕碰能量为35 V；m/z 426.20/147.0（多潘立酮），磕碰能量为35 V；m/z 716.81/518.83（SAB），磕碰能量为14 V；m/z 293.95/249.85（双氯芬酸钠），磕碰能量为10 V。

3 成果

3.1 专特点调查

取大鼠空白血浆或脑匀浆、大鼠空白血浆或脑匀浆加对照品和内标、给药后的大鼠血浆或脑匀浆（加内标），按2.2项下操作，色谱图见图1，成果标明，血浆和脑安排中内源性杂质不搅扰待测物和内标的测定，办法专特点杰出。

3.2 线性规模及定量下限调查

取对照品储藏液、大鼠空白血浆以及空白脑匀浆，经过倍比稀释得到规范血样和脑安排匀浆样品，按2.2项下样品前处理后进行剖析，以被测化合物的峰面积（Y）对其在血浆或脑匀浆中的浓度（C）用加权（1/C²） 最小二乘法进行回归运算，所得TSⅡ_a，SAB，GRg₁在大鼠血浆及脑匀浆中的规范曲线方程、线性规模、相关系数以及定量下限见表1。试验以S/N≥10作为定量规范。

3.3 精细度及精确度试验

取空白血浆和空白脑匀浆90 μL或180 μL，别离参加不同浓度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁对照品溶液10 μL或20 μL制备低、中、高质量浓度（TSⅡ_a血浆质量浓度为10，80，800 μg·L^-1；SAB血浆质量浓度为10，32，320 μg·L^-1；GRg₁血浆质量浓度为2，16，160 μg·L^-1；TSⅡ_a脑匀浆质量浓度为0.1，0.8，8 μg·L^-1；SAB脑匀浆质量浓度为10，32，320 μg·L^-1；GRg₁脑匀浆质量浓度为2，16，160 μg·L^-1）的QC样品，按2.2项下办法处理，每个浓度点5个样品，依法与规范曲线同批测定，接连测定3批（别离于3 d内完结），用随行规范曲线核算QC样品的浓度。据此求算办法的精确度和精细度。成果标明，血浆中TSⅡ_a日内、日间精确度别离为91.60%～93.14%（RSD≤4.1%，N=5），89.74%～91.48%（RSD≤5.8%，N=15）；脑匀浆中TSⅡ_a日内、日间精确度别离为95.20%～104.2%（RSD≤3.8%，N=5），102.7%～106.2%（RSD≤6.6%，N=15）；血浆中SAB日内、日间精确度别离为99.17%～110.5%（RSD≤6.3%，N=5），102.5%～106.2%（RSD≤7.3%，N=15）；脑匀浆中SAB日内、日间精确度别离为105.8%～106.5%（RSD≤3.4%，N=5），101.2%～105.2%（RSD≤8.0%，N=15）；血浆中GRg₁日内、日间精确度别离为101.9%～111.2%（RSD≤4.0%，N=5），96.37%～105.6%（RSD≤8.8%，N=15）；脑匀浆中GRg₁日内、日间精确度别离为87.42%～96.86%（RSD≤3.7%，N=5），90.31%～96.44%（RSD≤5.0%，N=15）。成果均契合生物样品剖析办法辅导准则的要求。

3.4 回收率调查

精确制造血浆或脑匀浆的低、高浓度质控（QC）样品，按2.2项下办法操作，记载待测物和内标的峰面积；一起用空白基质制造相应浓度的待测物和内标溶液进样得到的峰面积作为对照，每个浓度平行操作6份，回收率=血浆或脑匀浆样品的均匀峰面积/空白基质样品均匀峰面积×100%，成果用±s标明，见表2。选用相同的办法调查内标多潘立酮和双氯芬酸钠在血浆和脑匀浆中的回收率，成果多潘立酮在血浆及脑匀浆中的回收率别离为（98.1±2.97）%，（100.0±1.31）%；双氯芬酸钠在血浆及脑匀浆中的回收率别离为（69.8±1.85）%，（77.5±3.85）%。

3.5 基质效应

取空白血浆或空白脑安排匀浆和相对应体积的纯水，按2.2项下办法处理后，参加相应浓度的规范溶液，使得各待测组分的浓度与低、高质控样品浓度适当，每个浓度重复6次，记载空白生物基质峰面积A₁和水作为基质的峰面积A₂，基质效应=A₁/A₂×100%，成果用±s标明，见表2。内标多潘立酮在血浆及脑匀浆中的基质效应别离为（102.2±1.59）%，（83.4±0.520）%；内标双氯芬酸钠在血浆及脑匀浆中的基质效应别离为（176.4±2.760）%，（100.3±1.930）%。

3.6 安稳性试验

取空白血浆和空白脑匀浆80 μL或180 μL，别离参加不同浓度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁对照品溶液制备低、高浓度的QC样品，并置于以下4种条件下调查其安稳性： ①QC 样品于室温放置6 h后处理进样，成果显现在血浆及脑匀浆中各药物的精确度为-12.5%～6.34%；②将QC样本重复冻融3次后处理进样，成果显现各药物的精确度为-5.80%～13.9%；③将QC样品按2.2项下办法处理后，置于4 ℃放置24 h后进样，成果显现各药物的精确度为-12.5%～8.23%；④QC样本置于-20 ℃下儲存2周后，处理进样，各药物的精确度为-7.72%～8.65%。每个浓度点平行制备3份。成果标明血浆样本和脑匀浆样本在上述的4种处理条件下均安稳。

3.7 稀释办法学试验

制造高于定量上限的TSⅡ_a，SAB，GRg₁大鼠血浆样本，别离测定稀释8倍、3倍、8倍后的样品，用实测值乘以稀释倍数后，核算浓度是否为标明值的85%～115%。成果显现TSⅡ_a稀释8倍、SAB稀释3倍、GRg₁稀释8倍不会影响测定的精确度。

3.8 血浆及脑安排药动学研讨

所取血浆样本和脑匀浆样本别离按2.2项下办法处理，按2.3.1项下条件测定，记载各检测成分和内标的峰面积，代入回归方程，核算大鼠给药不一起相TSⅡ_a，SAB，GRg₁的血药浓度和脑安排浓度。所得数据用Phoenix WinNolin 6.1药动学程序软件进行非房室模型拟合，选用核算矩法核算药动学参数。各被测成分均匀血药浓度-时刻曲线、均匀脑安排药物浓度-时刻曲线见图2，首要药动学参数见表3。

4 评论

4.1 检测办法的断定

因为TSⅡ_a，SAB，GRg₁的极性、色谱行为等不同很大，SAB结构中有7个酚羟基和2个羧基，活动相的pH直接影响到峰形及呼应，本试验调查了不同活动相系统、活动相pH调节剂及色谱柱品种对三者保存时刻、峰形、呼应的影响，以一起到达峰形对称、剖析时刻短、呼应高的意图。本研讨发现以乙腈（0.1%甲酸）-0.25%甲酸水为活动相，在ACQUITY UPLCTM BEH 苯基柱上剖析时刻较短（7 min），呼应较高和峰形对称。

本试验测验运用正负离子一起检测以及正负离子形式分时刻段检测TSⅡ_a，SAB，GRg₁，但效果不抱负，即降低了3种被测物质的呼应，其间以SAB最为显着，达不到本研讨的测定要求，故只能2种形式分隔测定。本试验在优选各被测物质及内标的离子对时，发现TSⅡ_a的离子对m/z 295/277.1比m/z 295/249.30呼应更高，可是离子对m/z 295/277.1在空白血浆中搅扰很大，且挑选离子对m/z 295/249.30仍能满足本试验定量下限的测定要求，故挑选离子对m/z 295/249.30对TSⅡ_a进行检测。一起，本研讨在内标化合物选取上也进行了很多的探索，先后试用了地西泮、多潘立酮、泮托拉唑作为正离子形式内标，以其安稳性、色谱行为、质谱呼应及回收率为目标，归纳点评后断定以多潘立酮作为检测TSⅡ_a和GRg₁的内标物质；在挑选内标物时，本研讨曾测验文献[8]中运用过的氯霉素作为负离子形式下的内标物质，但因为空白血浆中搅扰很大，所以挑选峰型对称、安稳，与SAB有类似萃取行为的双氯芬酸钠作为内标。

4.2 提取办法的断定

本试验曾测验运用沉淀法一步进行样品前处理，该法虽简略但一起也稀释了待测样品，导致待测物质SAB定量下限不能满足本试验的测定要求，因而改用液-液萃取法对SAB进行提取。本研讨调查了不同提取溶剂，酸化试剂品种、浓度、体积对SAB提取率的影响，发现不同的提取溶剂对SAB的提取率影响较大，乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯-乙醚等有机溶剂提取回收率均低于乙酸乙酯，酸化试剂的品种、浓度及体积对SAB提取回收率影响较大，10%三氯乙酸、10%HCl溶液及其他体积1 mol· mL^-1HCl 溶液对SAB的提取率均低于1 mol· mL^-1HCl 溶液。一起也调查了1.5，2，3 mL乙酸乙酯对SAB萃取率的影响，2 mL与3 mL并无显着差异，均比1.5 mL 乙酸乙酯提取效率高，所以本试验样品处理时先用80 μL 1 mol· mL^-1盐酸酸化血浆样品，然后用2 mL乙酸乙酯直接提取血浆样品，SAB的提取回收率可达70%以上。本试验与文献[10-11]比较，极大地减少了有机溶剂乙酸乙酯的运用，得到了较好的提取回收率。

4.3 血浆及脑安排药动学成果剖析

从图2中可知，给药后15 min，大鼠血浆及脑安排中均能测到TSⅡ_a，SAB，GRg₁，阐明三者吸收速率和脑散布速率都很快，对脑缺血或脑缺血再灌注损害等急性脑部疾病能起到速效的效果。TSⅡ_a和GRg₁在给药后10 h仍能在大鼠血浆及脑安排中检测到，但SAB于给药后8，1.5 h，别离在血浆及脑安排中铲除彻底。从表3中可知，TSⅡ_a在血浆中的AUC0-t均大于SAB 和GRg₁，而TSⅡ_a的给药剂量（60 mg·kg^-1）均小于SAB（300 mg·kg^-1）和GRg₁（150 mg·kg^-1），提示TSⅡ_a的口服吸收较SAB，GRg₁更充沛，可能是因为SAB与GRg₁为亲水物质，很难透过小肠壁的脂质双分子层而形成口服生物利费用低下。从表3中可知，GRg₁的脑挑选性指数（0.43±0.24）高于TSⅡ_a和SAB（别离为0.001 8±0.002 1，0.031±0.013），可能是因为GRg₁与血红蛋白结合率较低，使其较易透过血脑屏障。有研讨标明，独自静注单体SAB，口服丹参或许静注SAB，TSⅡ_a与三七总皂苷提取物后，脑内无法检测到SAB^[8，12-13]，而本研讨于给药后15，30，60，90 min内均检测到SAB，可能是本研讨用UPLC-MS/MS检测SAB有更低的检出限和更高的灵敏度，或许复方丹参方中杂乱的成分以及芳香药龙脑有敞开血脑屏障的效果所造成的，一起也提示中医药复方配伍对方中有效成分药代动力学行为有明显影响，这也是中医药复方配伍优势地点，但仍需进一步研讨考证。

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[责任编辑 曹阳阳]