CD46单抗 CD123单抗润饰的载丹参酮ⅡA免疫脂质体的制备及其体外点评

王银+刘芙蓉+向虹霖+卿红+陈晨+毛声俊+李慧

[摘要] 研发CD123单抗润饰的载丹参酮Ⅱ_A免疫脂质体（CD123-TanⅡ_A-ILP），以期完成对白血病细胞的自动靶向给药。选用正交试验法优化脂质体处方，薄膜涣散-探头超声法制备载丹参酮Ⅱ_A长循环脂质体（TanⅡ_A-LP），今后刺进法得到CD123-TanⅡ_A-ILP。流式细胞术检测NB4细胞对脂质体的吸取率，改进MTT法检测CD123-TanⅡ_A-ILP对NB4细胞的增殖按捺效果。研讨成果标明，NB4细胞对CD123单抗润饰的免疫脂质体的吸取明显高于对游离药物及其载药脂质体的吸取；TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP与NB4细胞共培育48 h，其IC₅₀别离为20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1。CD123-ILP有望为AML的医治供给新的靶向给药战略。

[关键词] 丹参酮Ⅱ_A；CD123；免疫脂质体；NB4

[Abstract] In the study，we developed a novel formulation，CD123 mono-antibody （mAb） modified tanshinone Ⅱ_Aloaded immunoliposome （CD123-TanⅡ_A-ILP） to achieve the targeted drug delivery for leukemia cells. Orthogonal test was used to optimize liposome preparation，and the TanⅡ_A-loaded PEGylated liposomes （TanⅡ_A-LP） of S₁₀₀PC-Chol-（mPEG₂₀₀₀-DSPE）-TanⅡ_Aat 19∶5∶1∶1 molar ratio were prepared by the thin film hydration-probe ultrasonic method. A post-insertion method was applied to prepare CD123-TanⅡ_A-ILP via thiolated mAb conjugated to the terminal of maleimide-PEG₂₀₀₀-DSPE. The cellular uptake assay was measured by flow cytometry，and the inhibitory effect of CD123-TanⅡ_A-ILP on NB4 cells proliferation was tested by using MTT assay. The results of cellular uptake assay showed that CD123-ILP could significantly increase the drug uptake of NB4 cells as compared with free drugs and LP. The IC₅₀ values at 48 h incubation were 20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1 respectively for TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP and CD123-TanⅡ_A-ILP. CD123-ILP demonstrated a potential and promising targeted drug delivery strategy for acute myelogenous leukemia （AML） treatment.

[Key words] tanshinoneⅡ_A；CD123；immunoliposome；NB4

丹參酮Ⅱ_A（tanshinoneⅡ_A，TanⅡ_A）是中药丹参根中的首要脂溶性成分，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性[1]。有研讨标明，丹参酮Ⅱ_A可诱导肿瘤细胞分解、凋亡，按捺肿瘤的成长、增殖和侵袭性搬运[2]，其对白血病细胞株如K562[3]，NB4[4]，HL-60[5]等具有增殖按捺与促凋亡效果。

免疫脂质体给药体系是当时肿瘤靶向医治范畴的研讨热门之一。CD123系白介素-3受体（IL-3R）α链，为特异性高表达于急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）克隆性细胞及其干细胞外表的抗原，其可促进肿瘤细胞增殖、分解，并按捺细胞凋亡[6]。研讨标明，CD123阳性表达率与AML患者的生存期呈负相关，提示不良预后，故CD123可作为猜测复发率和生存率的点评目标[7-8]。由此可见，CD123为改进乃至彻底治愈AML供给了潜在的医治靶点[9]。据此，本研讨初次测验研发CD123单抗（monoclonal antibody，mAb）润饰的载丹参酮Ⅱ免疫脂质体（CD123-TanⅡ_A-ILP），以期为医治AML供给新的靶向给药战略。

1 资料

PHS-3C pH计（上海雷磁仪器厂）；R-201型旋转蒸腾仪（上海申顺生物科技有限公司）；DZF-6050型真空枯燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；SK5200H型超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；JY88-Ⅱ型超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研讨所）；微孔板恒温振动器（杭州奥盛仪器有限公司）；Zetasizer Nano-ZS90粒度剖析仪（英国Malvern）；安捷伦1100液相色谱仪（美国 Agilent）；IF-1型脂质体挤出器、聚碳酸酯膜（100 nm）（加拿大Avestin）；CO₂细胞培育箱（日本SANYO）；CFM-500型倒置荧光显微镜（上海长方光学仪器厂）；Model-680酶标仪（美国BIO-RAD）；TDL-50B型低速台式离心机（上海申安医疗器械厂）；FACSCalibur型流式细胞仪（美国BD Biosciences）。

TanⅡ_A（西安天丰生物科技有限公司，纯度≥99%）；注射用大豆磷脂（S₁₀₀PC）、mPEG₂₀₀₀-DSPE（德国 Lipoid）；Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE（美国Avanti Polar Lipids）；胆固醇（Chol）（上海惠世生化试剂有限公司）；BCA（Bicinchonininc acid）蛋白定量试剂盒、青霉素-链霉素溶液（江苏凯基生物）；3-（2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（SPDP）（美国Pharmacia Biotech）；二硫苏糖醇（DTT）、Ellman′s reagent（DTNB）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、透析袋（MWCO，7000）（美国Sigma-Aldrich）；葡聚糖凝胶Sephadex-G50（瑞典Pharmacia）；交联琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B（上海源叶生物）；RPMI-1640培育液、胎牛血清（美国Invitrogen Gibco）；鼠抗人CD123单克隆抗体（Clone 7G3）、鼠抗人CD123-APC、鼠IgG2a-APC（美国Becton Dickinson ）；AML细胞株NB4（American Type Culture Collection）；氯仿、甲醇、乙二胺四乙酸（EDTA）、二甲基亚砜（DMSO）为剖析纯，水为超纯水。

2 办法与成果

2.1 TanⅡ_A-LP的处方优化与制备

2.1.1 正交试验规划挑选处方 在单要素试验的根底上，以包封率为目标，选取S₁₀₀PC与Chol的摩尔比（A）、药脂比（B）、脂质体浓度（C）作为调查要素，每个要素选取3个水平，见表1。

2.1.2 TanⅡ_A-LP的处方优选 选用薄膜涣散-探头超声法制备TanⅡ_A-LP[10]。别离称取适量S₁₀₀PC，Chol，mPEG₂₀₀₀-DSPE，TanⅡ_A于混合溶液（氯仿-甲醇 2∶1）中，充沛溶解后将其移入25 mL圆底烧瓶中，于37 ℃下减压旋蒸15 min，除掉有机溶剂，使成均匀脂膜，真空枯燥4 h；参加适量磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）于上述圆底烧瓶中，超声水化脱膜，于37 ℃条件下恒温振动（200 r·min^-1）30 min，置冰水浴中探头超声100 s，整粒；续用脂质体挤出器（聚碳酸酯膜100 nm）挤出TanⅡ_A-LP，重复20次，制得粒径均一的载TanⅡ_A长循环脂质体混悬液。取TanⅡ_A-LP上样Sephadex-G50柱，以PBS进行洗脱，除掉TanⅡ_A游离药物。按不同处方制备的载药脂质体，试验成果见表2。药脂比是影响TanⅡ_A-LP包封率的首要要素，其次是S₁₀₀PC与Chol的摩尔比，脂质体浓度对包封率的影响最小。挑选的最佳处方断定为A₂B₃C₃，即S₁₀₀PC-Chol 4∶1；药脂比为1∶25；脂质体浓度为12 mmol·L^-1。按優化后的脂质体处方接连制备3批TanⅡ_A-LP，其间S₁₀₀PC-Chol-（mPEG₂₀₀₀-DSPE）-Tan Ⅱ_A =19∶5∶1∶1，测得其包封率别离为89.2%，92.9%，91.4%。

2.2 CD123-TanⅡ_A-ILP的制备

首要将CD123 mAb巯基化，选用SPDP作为抗体巯基化试剂，DTT作为还原剂[11]。用DMSO制造SPDP溶液（25 mmol·L^-1），用醋酸盐缓冲液（0.2 mmol·L^-1，pH 4.5，含5 mmol·L^-1 EDTA）制造DTT溶液（50 mmol·L^-1）。按CD123 mAb-SPDP=1∶10（摩尔比）混合，于室温下缓慢振动1 h，制得CD123 mAb-PDP。透析法除掉过量SPDP，醋酸盐缓冲液（pH 4.5）为透析液。按（CD123 mAb-PDP）-DTT 1∶10（摩尔比）混合，于室温充氮气维护下反响30 min，透析除掉DTT，透析液为PBS（含5 mmol·L^-1 EDTA），终究制得巯基化CD123 mAb。选用Ellmans法测定巯基化CD123抗体中的巯基量[12]，成果显现[SH]/[CD123]≈5，即标明每个CD123 mAb分子可生成约5个巯基。量取适量Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE溶液（溶于氯仿）于25 mL圆底烧瓶中，60 ℃下真空旋蒸1 h构成薄膜。将巯基化CD123 mAb参加上述薄膜中[CD123 mAb-（Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE） 1∶10（摩尔比）]，超声脱膜后封口置于微孔板恒温振动器中，于25 ℃，200 r·min^-1条件下振动12 h。CD123 mAb上的巯基与Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE中的马来酰亚胺基团中的双键发作加成反响，构成CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE胶束。按CD123 mAb-S₁₀₀PC 1∶400（摩尔比）向上述胶束中参加相应体积的TanⅡ_A-LP，于25 ℃，200 r·min^-1振动8 h，过凝胶CL-4B柱，以PBS为洗脱液，除掉游离CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE，即得CD123-TanⅡ_A-ILP。选用BCA蛋白定量试剂盒测定抗体衔接率和抗体结合功率，具体操作按BCA试剂盒操作阐明进行。依据7G3的相对分子质量约150 kDa，每个脂质体包括磷脂分子数约8万，可核算脂质体外表衔接的抗体的密度[13]。核算公式如下： CD123 mAb衔接率=（ILP中mAb含量/mAb参加量）×100%；CD123 mAb密度=[mAb摩尔量/mAb相对分子质量（150 kDa）]/S₁₀₀PC摩尔量×8万。核算成果显现，CD123 mAb的衔接率在45%～60%，CD123 mAb密度即每个脂质体上抗体个数约48个。

2.3 CD123-TanⅡ_A-ILP的药剂学特性表征

2.3.1 形状、粒径及Zeta电位的测定 选用磷钨酸负染，透射电镜法调查TanⅡ_A-LP，CD123-TanⅡ_A-ILP的形状，成果见图1。别离取200 μL TanⅡ_A-LP及CD123-TanⅡ_A-ILP，用PBS稀释10倍后，选用激光粒度剖析仪（Zetasizer Nano-ZS90）测定脂质体的粒径、多涣散系数（PDI）和 Zeta 电位。测得TanⅡ_A-LP粒径为（105.3±2.5） nm，PDI为0.12±0.04，Zeta电位为（-24.5±1.2） mv；CD123-TanⅡ_A-ILP的粒径为（113.3±3.5） nm，PDI为0.16±0.05，Zeta电位为（-34.8±1.8） mv。

2.3.2 包封率与载药量的测定 选用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定脂质体的包封率和载药量。取过柱后的TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP各100 μL，用PBS稀释至1 mL，参加1 mL无水乙醇，用力振摇损坏脂质体，静置10 min，使脂质体内包载的TanⅡ_A充沛溶解，溶液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液10 μL进样HPLC，色谱条件见参阅文献[14]。按上述办法操作，测得脂质体内的药物量MTan。另取含相同脂质体量的未过柱别离的脂质体溶液同法操作，测得药物总量MTotal。包封率（EE）=（MTan/MTotal）×100%；载药量=MTan/MLP×100%；MLP为载药脂质体的总质量。依据上述核算公式，测得TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP的包封率别离为（91.2±1.5）%，（88.6±2.1）%（n=3）；载药量为（1.36±0.02）%，（1.32±0.03）%。

2.3.3 脂质体稳定性调查 将TanⅡ_A-LP与CD123-TanⅡ_A-ILP在4 ℃条件下保存，别离测定其在不同时刻0，2，4，6，8，10，20，30 d的粒径和药物渗漏率，开始点评其物理稳定性。于预先设定的时刻点取样200 μL脂质体混悬液，过Sephadex-G50柱，除掉游离TanⅡ_A。按2.3.2项下办法测定药物含量，核算药物渗漏率。成果显现，放置10 d后制备的脂质体中药物渗漏率均不超越3%，30 d后脂质体中药物渗漏率均不超越5%；粒径改变不明显（P>0.05）；TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP溶液在各时刻点均未见分层及凝集现象，30 d时仍为均匀混悬液。

别的，调查TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP在PBS（pH 7.4）缓冲液中的稳定性。别离取1 mL不同脂质体制剂参加9 mL PBS，混合均匀，置于37 ℃恒温箱中，在不同时刻点0，4，8，12 h取1 mL混合液测定粒径、PDI调查其稳定性，见表3。由成果可知脂质体在37 ℃的PBS中，随时刻推移，粒径和PDI都略有上升，但改变不明显（P>0.05）。因为温度较高，TanⅡ_A随时刻改变缓慢开释，没有突释现象。

2.4 NB4细胞对CD123-ILP的吸取

NB4细胞为AML细胞FAB-M3型，该类AML亚型患者的白血病细胞上高表达CD123，100%的患者呈阳性表达（N=9）[15]，据此作者断定选用NB4细胞作为CD123-ILP的靶细胞。为便于调查与定量，在此项研讨中作者选用荧光物质香豆素-6（coumarin-6，Cou）为模型药物，制备载香豆素-6脂质体（Cou-LP）与载香豆素-6免疫脂质体（CD123-Cou-ILP），选用流式细胞术检测NB4细胞对Cou-LP，CD123-Cou-ILP的吸取差异。上述2种脂质体的制备办法按2.1.2项操作。

搜集对数期成长的NB4细胞，调整细胞密度至1×10⁶⁰个/mL，按每孔参加1 mL细胞接种于12孔板中。设置游离Cou，Cou-LP，CD123-Cou-ILP 3组，每组3个复孔。各组均稀释至相同药物浓度，每孔别离参加供试样品溶液200 μL，37 ℃下孵育1 h，空白组参加等量RPMI-1640培育基。搜集细胞，用预冷的PBS洗刷3次，除掉未与细胞结合的药物，参加200 μL PBS重悬，移置流式管中，混匀，上机检测。试验成果见图2。由各组细胞中的药物均匀荧光强度（MFI）可知，NB4细胞对CD123-Cou-ILP的吸取量别离为游离Cou，Cou-LP的3.5，2倍（P<0.01），标明脂质体经CD123 mAb润饰后，可明显添加靶细胞对其的吸取，有利于添加NB4细胞内的药物浓度。

2.5 NB4细胞增殖按捺效果调查

因为NB4细胞是悬浮细胞，因而选用改进MTT法[16]测定游离TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP對其增殖按捺效果。TanⅡ_A用DMSO溶解，制造成30 mmol·L^-1的储藏液，用RPMI-1640培育液稀释至浓度别离为1.0，5.0，10.0，20.0，30.0 μmol·L^-1，DMSO终究浓度小于0.1%（DMSO浓度小于0.1%时对细胞生机无影响）。TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP别离用RPMI-1640培育液稀释至相同系列浓度，0.22 μm滤膜过滤除菌，备用。搜集对数期成长的NB4细胞，调整细胞密度至1×10⁶⁰个/mL，按每孔加100 μL细胞接种于96孔板中。别离设置空白对照组、游离TanⅡ_A组、TanⅡ_A-LP组和CD123-TanⅡ_A-ILP组。各试验组每孔别离参加20 μL不同浓度的药物，每组设3个复孔。将96孔板置于培育箱中培育48 h，每孔参加20 μL MTT溶液（5 g·L^-1），持续培育4 h。培育完毕后每孔参加100 μL十二烷基硫酸钠（SDS）三联溶解液，置于培育箱中过夜，直至生成的甲瓒结晶彻底溶解，于酶标仪上测定波长570 nm（参阅波长680 nm）处的吸光度A，核算细胞按捺率和对折按捺浓度（IC₅₀）。每组试验均重复3次。不同制剂在系列TanⅡ_A浓度下的细胞按捺率见图3。经过SPSS 17.0软件核算TanⅡ_A，TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP的IC₅₀别离为20.87，11.71，7.17 μmol·L^-1。由成果可知，与游离TanⅡ_A比较，各浓度下TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP对NB4细胞的按捺率均有明显进步，其IC₅₀较TanⅡ_A别离降低了1.8，2.9倍（P<0.05）。

2.6 统计学处理

试验均重复3次，数据成果经过SPSS 17.0软件回归剖析，数值以±s表明，组间比较选用One way ANOVA查验，P<0.05为具有统计学差异。

3 评论

近年来靶向至CD123阳性表达细胞的免疫医治办法成为研讨热门，如bsscFv[CD123×CD123]和[CD123×CD12]首要通過诱导机体本身的CD16+天然杀伤细胞和CD3+ T细胞对CD123+AML细胞发作细胞免疫效应[17-18]。此外，以CD123介导的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）润饰T细胞为根底的肿瘤靶向免疫医治，经过基因润饰取得可辨认CD123受体的T细胞，进而开展成为进步T细胞靶向杀伤效果的个体化医治办法[19]。但是，现在没有见CD123 mAb润饰的微粒靶向给药体系的研讨报导。因而，本研讨初次测验将CD123 mAb润饰于脂质体外表制备免疫脂质体，以期完成对CD123+AML细胞的自动靶向给药。因为TanⅡ_A是多药耐药蛋白Pgp的底物与按捺剂，Pgp的外排效果和首过效应使其口服利费用极低[20]。CD123 mAb润饰的载TanⅡ_A免疫脂质体可经过CD123抗体与其抗原的特异结合，将载药脂质体选择性靶向AML细胞，进而经过脂质体与胞膜的交融效果，将抗癌药物导入肿瘤细胞内发挥效果[21]。

本试验选用薄膜涣散―探头超声法制备载TanⅡ_A长循环脂质体，其操作较为简略，适用于载脂溶性药物脂质体的制备。参加的mPEG₂₀₀₀-DSPE可添加脂质体的亲水性，削减脂质体间的集合而添加其稳定性，其可防止RES体系对脂质体的吞噬，延伸其血循环时刻，然后有利于进步肿瘤靶向功率[22]。将抗体衔接到脂质体外表的办法有几种[23]，本研讨首要使用抗体上的氨基与SPDP试剂反响，以DTT作为还原剂生成巯基，抗体上的巯基再与Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE上的马来酰亚胺基团发作化学交联反响生成CD123-PEG₂₀₀₀-DSPE，其DSPE端因具有亲脂性，易于刺进脂质体中而得到免疫脂质体，选用后刺进法的长处在于抗体均衔接在脂质体的外表，然后添加了抗体密度与可使用性。制备的TanⅡ_A-LP和CD123-TanⅡ_A-ILP粒径均在100 nm左右，免疫脂质体的粒径略有添加，这可能与CD123 mAb润饰有关。制备的脂质体在4 ℃条件下稳定性杰出，药物渗漏率低；在37 ℃，pH 7.4 PBS中，粒径和PDI略有升高，药物缓慢开释。流式成果标明，NB4细胞对CD123-Cou-ILP的吸取明显添加，有利于进步NB4细胞内的药物浓度。对NB4细胞的药效学研讨成果标明，CD123-TanⅡ_A-ILP可明显增强TanⅡ_A对AML细胞的增殖按捺效果，为其后续的体内抑癌研讨奠定了试验根底。

综上，CD123-ILP 有望为AML供给新颖的自动靶向给药载体，也为该类疾病的医治拓宽了新的靶向给药战略。

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[责任编辑 孔晶晶]