丹参提取物水溶性：丹参水溶性成分丹酚酸A对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的防治效果及机制
吴雄健++++++郑虹++++++朱海燕++++++毛忠懿++++++谢军
[摘要]意图 评论丹参水溶性成分丹酚酸A对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的防治效果及机制。办法 选取成年健康雄性SD大鼠48只，隨机分为假手术组、模型组、丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1），每组各12只。除假手术组外均打针CCl4制造大鼠肝纤维化模型。丹酚酸A组于造模8周后给予丹酚酸A 10 mg/（kg·d）腹腔打针，Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）于造模8周后予以DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔打针，而假手术组和模型组均于造模8周后予以等量生理盐水腹腔打针。给药医治6周后，处死各组试验动物，搜集肝右叶中部两块肝安排进行检测，其间一块使用10%的甲醛进行固定并制备白腊切片；另一块置于-70℃冰箱中保存备用，用于分子生物学检测。成果 经Western blot检测发现，模型组的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平。模型组的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平。模型组的Gsk3β、β-catenin表达水平显着高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显着低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调Gsk3β、β-catenin的表达水平。定论 丹酚酸A可能是经过激活Wnt/β-catenin信号通路来按捺肝纤维化。
[关键词]肝纤维化；大鼠；丹参；丹酚酸A
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）10（b）-0004-04
[Abstract]Objective To explore the preventive effect and mechanism of salvianolic acid A of water-soluble component from Salvia miltiorrhiza on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats.Methods 48 adult male SD rats were selected and randomly divided into the sham group，the model group，the salvianolic acid A group，and the Wnt channel blocker group （DKK-1），with 12 rats in each group.Except the sham group，the CCl4 was injected in other three groups to establish hepatic fibrosis model in rats.In the salvianolic acid A group，10 mg/（kg·d） salvianolic acid A was intraperitoneally injected after 8-week modeling.In the Wnt channel blocker group，the DKK-1 and 10 mg/kg salvianolic acid A were intraperitoneally injected after 8-week modeling.For the sham group and the model group，the same volume of saline was intraperitoneally injected after 8-week modeling.The rats were sacrificed 6 weeks after medications.Two liver tissues from the middle of the right lobe of the liver were collected for test.One of them was fixed with 10% formaldehyde and prepared into paraffin sections.The other one was stored in a refrigerator at -70℃ for molecular biological detection.Results By Western blot detection，the expression of α-SMA，TIMP-1 and Collagen Ⅰ proteins in the model group was significantly higher than that in the sham group，while in the salvianolic acid A group and Wnt channel blocker group，the proteins expression mentioned above could be obviously down-regulated after the corresponding therapy.In the model group，the expression levels of α-SMA，MMP-2，TIMP-1，Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA were much higher compared with those in the sham group，while in the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，these indexes were greatly down-regualted after the related therapy.The Gsk3β and β-catenin expression levels in the model group were much higher than those in the sham group.The β-catenin expression level was extremely higher than that in the sham group.In the salvianolic acid A group and the Wnt channel blocker group，after the corresponding therap，the Gsk3β and β-catenin expression levels could be significantly down-regulated.Conclusion Salvianolic acid A may inhibit hepatic fibrosis by activating Wnt/β-catenin signal pathway.endprint
[Key words]Hepatic fibrosis；Rat；Salvia miltiorrhiza；Salvianolic acid A
肝纖维化是各种缓慢肝炎发展为肝硬化的必经病理阶段，严重影响肝脏的功用[1]，因而，采纳有用药物医治手法按捺或反转肝纤维化至关重要[2]。肝纤维化的发病机制很杂乱，触及多条信号通路的改动以及多种蛋白表达水平的改动。研讨显现，Wnt/β-catenin信号途径与肺及肾纤维化的构成密切相关，但该通路与肝纤维化的联系尚不清晰[3]。本研讨使用丹酚酸A对大鼠肝纤维化模型进行干涉医治，调查丹酚酸A对四氯化碳（CCl4）致试验性肝纤维化大鼠肝安排表达的影响，旨在为医治肝纤维化寻求新的医治靶点。
1材料与办法
1.1材料
成年健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠48只，体重200 g左右，均由广东省农业科学院动物卫生研讨所供给，许可证号：SYXK（粤）2016-0165。除假手术组外，大鼠轮替背部皮下及四肢内侧打针40% CCl4橄榄油混悬液3 ml/kg体重，每周2次，共8周，以树立肝纤维化动物模型。
1.2办法
1.2.1分组及给药 造模后8周，对大鼠施行随机分组，分为假手术组、模型组、丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1），每组12只，并进行不同的处理，各组详细给药办法如下：假手术组和模型组单纯选用等量生理盐水腹腔打针；丹酚酸A组于造模8周后予丹酚酸A（姑苏巨能世纪信息科技有限公司）10 mg/（kg·d）腹腔打针；Wnt通道阻滞剂组（DKK-1，由上海江莱生物科技有限公司供给）于造模8周后予DKK-1和丹酚酸A 10 mg/kg腹腔打针。
1.2.2标本搜集 给药医治6周后，处死各组试验动物，搜集各组肝安排，称取肝脏湿重，并切取肝右叶中部2块肝安排进行检测，其间一块使用10%的甲醛（上海江莱生物科技有限公司）进行固定，制备白腊切片；另一块置于-70℃冰箱（由河北方地区辉试验仪器有限公司供给）中保存备用，用于分子生物学检测。
1.2.3调查目标与检测 ①肝纤维化相关目标的检测：选用HE染色剖析肝纤维化的程度，选用Isak评分体系对肝纤维化程度进行评分，选用免疫组化法调查大鼠肝安排中MMP-2、TIMP-1、Tcf-4、α-SMA的表达，选用RT-PCR检测大鼠肝安排中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、α-SMA mRNA的表达状况。②Wnt/β-catenin信号通路相关目标的检测：选用免疫组化法调查大鼠肝安排中β-catenin的表达，选用Western-blot检测大鼠肝安排中β-catenin蛋白的表达，选用RT-PCR检测大鼠肝安排中GSK-3β、β-catenin、Wntl、Wnt3α、Wntlob mRNA的表达状况。
1.3统计学处理
选用SPSS 19.0统计学软件对试验相关数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，组间比较选用单因素方差剖析，两两比较选用LSD-t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1四组α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白表达水平剖析
经Western blot检测发现，模型组的α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白水平显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平（图1）。
2.2各组α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平的比较
模型组的α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平（图2）。
2.3各组Gsk3β、β-catenin蛋白表达水平的比较
模型组的Gsk3β、β-catenin表达水平显着高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显着低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调Gsk3β、β-catenin的表达水平（图3）。
3评论
肝病是一种常见疾病，会对人体健康形成不同程度的影响。肝纤维化是缓慢肝病所共有的病理改动，是肝脏对缓慢损害的修正反响，被视为各种缓慢肝病导致严重后果的一起途径[4]。怎么促进肝纤维化的反转，是防备和医治肝硬化的有用办法之一。
丹参是一种临床使用较多的中药之一，被广泛使用于抗肝纤维化医治之中。丹参中含有的丹酚酸A是丹参的首要水溶性成分之一，在丹参水溶性成分中占有重要位置[5]。研讨显现，丹酚酸A具有很强的抗氧化、抗肝损害、抗肝纤维化等效果[6]，能够经过铲除超氧阴离子和羟自由基，按捺脂质过氧化反响，进而减轻肝损害。鲁珽等[7]的动物试验显现，针对CCl4致大鼠肝纤维化施行丹酚酸A打针医治效果切当，医治效果显着优于口服50 mg/kg丹酚酸胶囊医治，能够发挥出更好的抗肝纤维化效果，能够更好地改进试验动物的临床体征，并改进动物的肝脏器系数等目标。丹酚酸A能够按捺体外培育的成纤维细胞，激活胶原酶，促进胶原蛋白降解[8]。体内试验显现，丹酚酸A可下降CCl4缓慢中毒大鼠的血清ALT、AST活性和肝安排丙二醛的含量，进而从全体上证明了丹酚酸A有显着抗脂质过氧化肝损害的效果[9]。别的，丹酚酸A还可下降肝脏羟脯氨酸的含量，减轻肝安排纤维化程度，按捺肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原堆积，具有显着的抗肝纤维化效果[10]。丹酚酸A还能够按捺HSC的活化与增殖，削减ECM的组成，阻挠肝纤维化的进程，因而，丹酚酸A可作为抗肝纤维化医治的有用药物，丹酚酸A按捺肝星状细胞增殖与胶原表达是其抗肝纤维化的首要效果机制[11]。经过本次研讨发现，经Western blot检测，模型组α-SMA、TIMP-1和Collagen Ⅰ蛋白显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平。肝纤维化的出现是由人体内以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质组成与降解发作失衡现象所导致，正常状况下，人体的肝脏中细胞外基质在组成以及降解方面处于动态平衡的状况[12]，其间，肝星状细胞是组成细胞外基质的首要来历，在必定状况下，肝脏受损之后，肝星状细胞便会发作必定的改动，被激活或转分化为肌纤维母细胞[13]，进而表达很多的α-SMA及细胞珠蛋白，并排泄出很多的细胞外基质；一起，其能够经过正反馈的办法，对肌纤维母细胞的增殖发生显着的调节效果[14]，并且在组成细胞外基质的一起，肝星状细胞也会排泄很多对细胞外基质发生降解效果的基质金属蛋白酶（MMPs）[15]。本次研讨成果还显现，模型组α-SMA、MMP-2、TIMP-1、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA表达水平显着高于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调上述目标的表达水平；模型组Gsk3β、β-catenin表达水平显着高于假手术组，β-catenin蛋白表达水平显着低于假手术组，而丹酚酸A组和Wnt通道阻滞剂组（DKK-1）经相应的医治之后能够显着下调Gsk3β、β-catenin的表达水平，提示丹酚酸A在医治β肝纤维化的过程中，发挥相关效果的机制可能是经过对经典的Wnt信号转导通路予以按捺，进而促进肝星状细胞增殖水平的下降，以及细胞外基质降解的增加来予以完成[16]。endprint
综上所述，经过本次研讨，从安排水平、蛋白水平缓基因水平证明丹酚酸A可能是经过激活Wnt/β-catenin信号通路来按捺肝纤维化，从而为使用丹酚酸A医治肝纤维化供给新的医治靶点，为丹酚酸A在肝纤维化中的临床使用供给了理论基础。
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