独活寄生汤 独活寄生汤对硝普钠诱导软骨细胞凋亡模型增殖的影响

王武炼　林煜　张怡元　刘振涛　肖莉莉　刘献祥

[摘要] 意图 评论独活寄生汤含药血清对硝普钠诱导的膝软骨细胞凋亡模型增殖的影响。 办法 不同浓度硝普钠（SNP）诱导软骨细胞凋亡，MTT法检测软骨细胞对折致死量（LD50）的硝普钠浓度，以断定硝普钠最佳诱导浓度；10%独活寄生汤含药血清干涉72 h后，光学显微镜调查细胞形状改动；Hoechst 33258染色，荧光倒置显微镜调查细胞凋亡状况。qPCR法检测各组转化成长因子β1（TGF-β1）mRNA的表达。 成果 1 mM硝普钠为最佳诱导浓度；含药血清干涉后，软骨细胞的凋亡率下降，干涉组低于模型组，空白组软骨细胞中TGF-β1 mRNA的表达最高，模型组最低，干涉组介于两组之间，各组比较差异有统计学含义（P<0.01）。 定论 独活寄生汤含药血清能按捺硝普钠诱导体外培育的膝软骨细胞凋亡模型的凋亡。

[要害词] 独活寄生汤；凋亡；软骨细胞；增殖

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）34-0098-03

Effects of parasitic soup on proliferation of chondrocyte apoptosis model induced by sodium nitroprusside

WANG Wulian1 LIN Yu1 ZHANG Yiyuan1 LIU Zhentao1 XIAO Lili1 LIU Xianxiang2

1.Department of Joint Surgery， Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University， Fuzhou 350007， China； 2.Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350102， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of serum containing parasitic soup on the proliferation of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside. Methods Since different concentrations of sodium nitroprusside （SNP） induced chondrocyte apoptosis，the half-lethal dose（LD50） concentration of sodium nitroprusside sodium nitroprusside（SNP） in chondrocyte cell was determined by MTT assay to determine the optimal concentration of sodium nitroprusside（SNP）. The morphological changes of the cells were observed by light microscope after treated with 10% for 72 h. After being stained by the dye Hoechst 33258， cell apoptosis was observed by fluorescence inversion microscope. The expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1） mRNA was detected by qPCR. Results 1 mM sodium nitroprusside was the best induction concentration. The apoptosis rate of chondrocytes decreased after treatment with serum containing drugs，and the apoptosis rate of the intervention group was lower than that of model group.The expression of TGF-β1 mRNA in the chondrocytes in the blank group was the highest， the lowest in the model group and the level of TGF-β1 mRNA in the treatment group was between the two groups. There was significant difference between the three groups（P<0.01）. Conclusion The serum containing parasitic soup can inhibit the apoptosis of knee chondrocytes apoptosis model induced by sodium nitroprusside in vitro.

[Key words] Parasitic soup； Apoptosis； Chondrocytes； proliferation

軟骨细胞的凋亡是膝骨关节炎（KOA）的发作发展中重要环节，而一氧化氮（NO）在软骨细胞的凋亡中起着要害效果。前期研讨显现独活寄生汤医治OA久痹而致肝肾两虚，气血缺乏证能取得杰出效果[1]。本研讨选用硝普钠诱导软骨细胞NO调控通路，促进其凋亡来模仿OA发展进程，并用独活寄生汤含药血清干涉凋亡模型，评论独活寄生汤对体外软骨细胞凋亡模型的影响，为临床防治KOA供给参阅。

1 材料与办法

1.1 试验动物及药物

2月龄雄性清洁级SD大鼠40只，4周龄SPF级SD大鼠10只[上海斯莱克试验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2007-0011]。独活寄生汤剂量及组成参照唐·孙思邈《备急千金要方》原方（厦门大学隶属福州第二医院药剂科）。

1.2 试剂及检测仪器

DMEM 低糖培育基、BPS、0.25%胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（Hyclone公司）；胎牛血清（四季青公司）；Ⅱ型胶原酶粉末（Sigma公司）；Hoechst 33258试剂盒（Invitrogen公司）；Prime ScriptTM RT和SYBRR PCR Kit（宝生公司）；二氧化碳培育箱，Elx800酶标仪（美国BioTek公司），荧光倒置相差显微镜（徕卡仪器公司）。

1.3 办法

1.3.1 含药血清制备 随机将2月龄清洁级雄性SD大鼠40只分为生理盐水对照组13只[按10 mL/（kg·d）的量给予0.9%生理盐水]和独活寄生汤临床等效剂量组27只[按9.3 g/（kg·d）的量给予独活寄生汤]。接连灌胃7 d，在末次灌胃2 h后，腹主动脉采血、离心，取血清，-20℃冻存。

1.3.2 软骨细胞别离培育与判定 取4周龄SD大鼠的膝关节软骨，选用Ⅱ型胶原蛋白酶消化法别离软骨细胞，培育调理为：5% CO2，1次/2 d替换培育基，选用倒置相差显微镜调查别离的细胞，待细胞贴壁至80%后进行传代。取第2代细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化法染色，判定别离细胞是否为软骨细胞。

1.3.3 断定最佳诱导浓度 将密度为1×104细胞接种于96孔板，在培育基中参加硝普钠，终浓度调整为0、0.5、1、2、3 mM，24 h孵育，MTT检测细胞在不一起间段下的存活率，对折致死量（LD50）最低的浓度即为最佳干涉浓度。

1.3.4 细胞分组、形状调查及干涉 将细胞以1×105个/mL接种于培育瓶中，过夜贴壁后持续培育24 h，随后分为3组。A组空白组（10%空白血清干涉）；B组模型组（硝普钠诱导凋亡+10%空白血清干涉）；C组干涉组（硝普钠诱导凋亡+10%独活寄生汤含药血清干涉）。72 h后调查细胞形状学改动，依据Hoechst33258阐明书对细胞核染色，之后选用荧光显微镜摄影。收集各组软骨细胞，并进行目标检测。

1.3.5 qPCR檢测细胞TGF-β1的表达 用Trizol提取各组别软骨细胞总RNA，并按照阐明书逆转录后在7500PCR仪上扩增，终究将所得CT值由软件换算成终究值。TGF-β1引物：5ACGCAACCAACATCCGCTA 35ACCGGTAAACCAGAGGAAT3；β-actin引物：5 CTTGACGGAGAAAAAGCCTC 35GCACAGTGAGGCTTGAACAA 3。

1.4 统计学办法

选用SPSS18.0软件，计量材料以（x±s）标明，选用t查验或单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学含义。

2成果

2.1 提取的软骨细胞形状改动及判定

刚从膝软骨别离的软骨细胞呈圆形并悬浮于培育液中，1 d后开端贴壁，3 d后贴壁细胞加速割裂增殖，5 d后软骨细胞呈铺路石样并成簇成长；培育至第8 d细胞增殖铺满瓶底。培育进程可见第2、3代细胞增殖速度最快、排泄基质的才能最强；当传至第4代后，细胞增殖速度减慢、体积增大、细胞核变大、胞膜和胞浆逐突变含糊，一起细胞形状变得不规矩，呈纤维细胞样改动。免疫组化判定显现：培育的细胞胞核不上色，胞浆呈棕黄色，即提取的细胞Ⅱ型胶原表达呈阳性（图1）。

2.2硝普钠诱导软骨细胞凋亡的剂量联系

试验成果显现，跟着SNP浓度的添加，细胞的生机逐步下降，具有浓度依靠性（图2）。成果显现对折致死率（LD50）为（1.145±0.073）mM。因而，本研讨中选用1 mM SNP孵育24 h来诱导软骨细胞的凋亡模型。

2.3 独活寄生汤含药对SNP诱导的软骨细胞凋亡模型细胞形状学改动的影响

硝普钠干涉软骨细胞24 h后，各组细胞形状改动显着：空白组细胞成簇成长，形状规矩、鸿沟清楚，以梭形和椭圆形为主，细胞核边际规整、巨细较均一（封三图4A）；SNP诱导后，细胞变圆、变亮或萎缩，乃至彼此别离或起浮在培育液中，细胞呈现细胞核细密浓缩、核变亮、核碎裂或月牙状等细胞凋亡特征（封三图4B）；经过独活寄生汤含药血清干涉后，变圆、变亮或萎缩，乃至彼此别离或起浮在培育液中的细胞显着削减（封三图4C）。

2.4 独活寄生汤含药血清对软骨细胞凋亡模型TGF-β1的影响

SNP干涉软骨细胞24 h后：空白组软骨细胞中TGF-β1mRNA的表达最高相对表达量为1，模型组最低为（0.452±0.012），干涉组介于二组之间为（0.653±0.023），各组差异有统计学含义（P<0.01）。

3 评论

当时软骨细胞的提取多选用两种酶联合序贯消化法，可是因为别离进程较多、操作杂乱，且一起运用或许会对软骨细胞形成损害[2-5]。有研讨单纯选用Ⅱ型胶原蛋白酶别离膝软骨细胞，成果显现别离后软骨细胞活性杰出[6，7]。因而本研讨选用Ⅱ型胶原酶消化法别离大鼠膝软骨细胞：细胞培育成果证明选用此法不只简化了别离的进程，还削减了因多种酶重复消化、洗刷、离心而对软骨细胞形成的损害，从而使别离取得的细胞具有杰出的活性。在原代软骨细胞贴壁传代后软骨细胞贴壁和增殖的速率均加速，传代至第2、3代细胞增殖速度最快、排泄基质的才能最强，第4代后则呈“去分解”现象，这与之前文献研讨定论相一致[8-10]。

KOA软骨细胞凋亡首要经过NO诱导途径和Fas介导途径发作，其间以NO依靠通路更重要[11]。硝普钠是一种由NO发作的供体，在KOA的发作前期阶段， NO发作的硝普钠等供体可诱导培育的软骨细胞凋亡且存在时刻效应联系，因而NO及其产品升高导致软骨细胞凋亡是KOA发作的细胞机制[12，13]。因而，SNP作为NO的一种供体能模仿KOA患者关节腔内的微环境，仿制体外培育软骨细胞凋亡的进程。TGF-β1是软骨的成长和重建的重要因子，影响着软骨细胞的增殖分解，一起发挥软骨诱导效果、促进软骨基质组成起着要害的效果。软骨细胞凋亡模型中的TGF-β1的表达与其细胞状况和增殖才能呈正相关，并终究与KOA的病情严重程度呈负相关性[14，15]。

本文使用硝普钠仿制软骨细胞的凋亡模型，成果发现，跟着SNP浓度的添加，细胞的生机逐步下降，且具有浓度依靠性。而经过独活寄生汤含药血清干涉后，培育液中的凋亡细胞显着削减，标明独活寄生汤含药血清能按捺硝普钠诱导体外培育的膝软骨细胞凋亡模型的凋亡。一起本研讨选用Hoechst 33258染色调查其对软骨细胞细胞核形状学改动的影响，成果发现SNP诱导后，软骨细胞呈现细胞核细密浓缩、核变亮、核碎裂或月牙状等细胞凋亡特征，经过独活寄生汤含药血清干涉后，凋亡软骨细胞显着下降，而各组细胞中以空白组中TGF-β1mRNA的表达最高，模型组最低，干涉组介于两组之间，各组比较差异有统计学含义（P<0.01），阐明独活寄生汤或许经过按捺NO发作，进步软骨细胞的凋亡模型中TGF-β1的表达，发挥按捺软骨细胞的凋亡模型其退变的效果。总归，独活寄生汤含药血清能按捺硝普钠诱导的软骨细胞凋亡模型的凋亡，这或许是独活寄生汤医治KOA的机制之一。

[参阅文献]

[1] 吴广文，褚剑锋，许惠凤，等. 独活寄生汤的药理效果及其在医治骨性关节炎中的使用[J]. 中医正骨，2012，24（1）：37-39.

[2] Iakoubov R，Ahmed A，Lauffer LM，et al. Essential role for protein kinase Cζ in oleic acid-induced glucagon-like peptide-1 secretion in vivo in the rat[J]. Endocrinology，2011， 152（4）：1244-1252.

[3] Zhao H，Liu J，Song L，et al. Oleanolic acid rejuvenates testicular function through attenuating germ cell DNA damage and apoptosis via deactivation of NF-κB，p53 and p38 signalling pathways[J]. J Pharm Pharmacol，2016，9（10）：1111.

[4] 张艳，柴岗，刘伟，等. 体外培育进程中去分解的人软骨细胞基因表达谱的改动[J]. 中华整形外科杂志，2007， 23（4）：331-334.

[5] 司徒镇强，吴军正. 细胞培育[M]. 北京：世界图书出版社，2004：250-252.

[6] Ryu JH，Chun JS. Opposing roles of WNT-5A and WNT-11 in interleukin-1 beta regulation of type Ⅱ collagen expression in articular chondrocytes[J]. J Bilo Chem，2006，281（31）：22039-22047.

[7] Nalesso G，Thomas BL，Sherwood JC，et al. WNT16 antagonises excessive canonical WNT activation and protects cartilage in osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis，2017，76（1）：218-226.

[8] Irie Y，Mizumoto H，Fujino S，et al. Reconstruction of cartilage tissue using scaffold-free organoid culture technique[J]. J Biosci Bioeng，2008，105（5）：450-453.

[9] Huang Y，Wan G，Tao J. C1q/TNF-related protein-3 exerts the chondroprotective effects in IL-1β-treated SW1353 cells by regulating the FGFR1 signaling[J]. Biomed Pharmacother，2016，85（32）：41-46.

[10] 劉小荣，张笠，高武，等. 新西兰兔关节软骨细胞别离培育与判定的试验研讨[J]. 世界查验医学杂志，2012， 33（19）：2307-2312.

[11] Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors[J]. Cancer，2000，89（12）：2637-2645.

[12] Li H，Huang L，Xie Q，et al. Study on the effects of gradient mechanical pressures on the proliferation，apoptosis，chondrogenesis and hypertrophy of mandibular condylar chondrocytes in vitro[J]. Arch Oral Biol，2017， 73（13）：186-192.

[13] Shen P，Li X，Xie G，et al. Time-dependent effects of arthroscopic conditions on human articular cartilage：An in vivo study[J]. Arthroscopy，2016，32（12）：2582-2591.

[14] Yoshifusa A，Toru S，Craig B. TGF-β1 stimulates mitochondrial oxidative phosphorylation and generation of reactive oxygen species in cultured mouse podocytes，mediated in part by the mTOR pathway[J]. American Journal of Physiology-Renal Physiology，2013，305（10）：1477- 1490.

[15] Blanco FJ，Ochs RL，Schwarz H，et al. Chondrocyte apoptosis induced by nitric oxide[J]. Am J Pathol，1995，141（1）：75-85.

（收稿日期：2016-09-23）