印戒细胞胃癌 染料木素对人胃癌MGC—803细胞增殖及PKA活性的影响
韩银淑
[摘要] 意图 本文通过研讨染料木素（Gen）对体外培育MGC-803细胞增殖以及PKA活性的影响，评论Gen按捺MGC-803细胞系增殖的分子机制。办法 光镜下查询经Gen处理后人胃癌MGC-803细胞形状学改动；使用MTT法检测Gen对体外培育的人胃癌MGC-803细胞增殖影响；PepTag法检测Gen对MGC-803细胞PKA活性的调理。成果 与空白对照组比较，经Gen处理后MGC-803细胞外形呈不规则状、细胞空隙增大、折光性差；MTT试验发现Gen可以按捺体外培育的MGC-803细胞增殖，而且按捺效果出现时刻及浓度依靠性；浓度为40 μg/mL的 Gen可以显着上调MGC-803细胞的PKA活性（P<0.01）。定论 Gen对人胃癌细胞系MGC-803细胞的增殖有按捺效果，上调PKA活性可能是Gen按捺人胃癌MGC-803细胞增殖的机制之一。
[关键词] 染料木素；MGC-803细胞；PKA活性
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）28-0001-03
染料木素（Genistein，Gen）是一种来源于大豆或其他豆科植物的大豆异黄酮，其具有类雌激素、抗氧化、调理血脂等生物活性。流行病学研讨和试验研讨证明Gen能下降乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依靠型肿瘤的发生率，对激素依靠型肿瘤的防备和医治有必定的效果。此外，Gen对消化道肿瘤也有显着的按捺效果，但是其抗肿瘤效果机制尚不清楚[3]。本文通过研讨Gen对人胃癌细胞MGC-803增殖及PKA活性的影响，评论Gen按捺MGC-803细胞系增殖的分子机制，为Gen在临床上的使用供给理论依据。
1 资料与办法
1.1细胞系
人胃黏液性腺癌细胞株MGC-803由齐齐哈尔医学院中心试验室赠予。培育基选用RPMI-1640彻底培育液，加10%灭活hyclon胎牛血清、100 IU/mL链霉素和100 IU/mL青霉素。搜集MGC-803细胞，稀释至1×105/mL，接种于培育皿，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培育。当MGC-803细胞成长覆盖了80%培育皿表面积时要传代，试验时取成长状况杰出的对数成长期细胞。
1.2 药物与试剂
RPMI-1640培育基为Invitrogen产品；胎牛血清为Hyclon产品；Aprotinine、PMSF、DTT、EGTA为Sigma-Aldrich产品；PKA活性检测试剂盒为Promega产品。Gen为陕西天行健生物化学技能有限公司产品，用1 mL MSO溶解配成浓度为40 mg/mL原液，4℃冰箱保存。试验时用培育液将Gen溶液稀释到所需求的浓度。
1.3首要试验仪器
Milli-Q超纯水体系为MILLIPORE产品；CO2培育箱为NuAire出产；电泳槽为BIO-RAD；CKX31型倒置显微镜为日本Olympus；IF-90紫外透射仪为上海顾林电光仪器厂出产。
1.4 试验办法
1.4.1 Gen对MGC-803细胞增殖的影响 试验设空白组（彻底培育基）、空白对照组和Gen处理组。将对数成长期MGC-803细胞搜集、离心并去除上清液，稀释MGC-803细胞至5×104个/mL。按每孔200 μL将MGC-803细胞接种于3块96孔培育板，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培育24 h。然后弃除培育液，Gen处理组别离参加用RPMI-1640培育液稀释的不同浓度Gen溶液200 μL/孔（Gen浓度别离为2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL）， 空白对照组则加RPMI-1640培育液200 μL/孔，空白对照组和Gen处理组均设3个平行孔。在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下别离培育24 h、48 h和72 h，各组均在试验停止前4 h时加5 mg/mL浓度的MTT 20 μL/孔，并于4 h后弃除上清液，每孔再加DMSO 150 μL。以空白组（彻底培育基）将酶标仪调零，570 nm波长下测定OD值，核算Gen对GMC-803细胞增殖的按捺率。细胞增殖按捺率=（1-Gen处理组均匀OD值/空白对照组均匀OD值）×100%，试验成果重复3次。
1.4.2 Gen对MGC-803细胞形状学影响 试验设空白对照组和Gen处理组。上述两组均培育24 h后移除培育液，空白对照组加200 μL/孔的RPMI-1640培育液，Gen处理组每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各组均设平行孔3个。37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培育24 h后，光镜下查询经Gen处理后MGC-803细胞形状学的改动。
1.4.3 Gen对MGC-803细胞PKA活性的调理 搜集对数成长期的MGC-803细胞，稀释至5×104个/mL，接种于培育皿，并随机分为空白对照组、40 μg/mL Gen处理组。空白对照组加200 μL/孔的RPMI-1640培育液，40 μg/mL Gen处理组每孔加40 μg/mL Gen溶液200 μL，各组均设平行孔3个，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下培育48 h。按试剂盒阐明别离进行样品提取、考马斯亮蓝法测定蛋白、别离磷酸化和非磷酸化的PepTag短肽、荧光光度计定量分析检测PepTag成果及核算各组的PKA活性。
1.5 计算学办法
试验数据用SPSS13.0进行计算学处理，一切数据经正态性查验均遵守正态分布。计算描绘以均数±标准差（x±s）标明，选用单因素方差分析比较多组间均数，进一步的两两比较则别离选用SNK法和Dunnet-t查验。两组间选用配对t查验，P<0.05差异具有计算学含义。
2 成果
2.1 Gen对MGC-803细胞增殖的影响
MTT试验发现Gen对体外培育的MGC-803细胞增殖有按捺效果，且按捺效果呈时刻及浓度依靠性。用Gen处理24 h后，10 μg/mL Gen组、20 μg/mL Gen组、40 μg/mL Gen组与空白对照组比较，对MGC-803细胞的按捺效果显着（P<0.01）；Gen处理48h后，5 μg/mL组、10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组对MGC-803细胞的按捺效果显着（P<0.01）；而处理72 h后，一切Gen处理组均对MGC-803细胞有显着按捺效果（P<0.01）。Gen处理48 h和72 h与24 h比较，Gen浓度为10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组与空白对照组比较有按捺效果（P<0.05），而关于2.5 μg/mL组，仅处理72 h时有按捺效果（P<0.05）。Gen处理72 h与48 h相比较，Gen浓度为10 μg/mL组、20 μg/mL组、40 μg/mL组按捺效果有计算学含义（P<0.05）。在Gen浓度为40 μg/mL时，处理72 h后对MGC-803按捺率达72.3%，见表1。
2.2 Gen对MGC-803细胞形状的影响
光镜下可见空白对照组MGC-803细胞成长状况杰出，贴壁成长旺盛。细胞外形概括明晰、细胞间结构严密、巨细均匀，出现多边形或梭形，且细胞质的折光性较强。而通过Gen处理后，发现MGC-803细胞成长状况较差，细胞外形出现圆形或不规则状、细胞空隙显着增大，且细胞质折光性较差，见图1 。
2.3 Gen对MGC-803细胞PKA活性的调理
选用浓度为40 μg/mL的Gen处理MGC-803细胞，培育48h后检测PKA活性。试验成果显现，空白对照组PKA活性为（0.571±0.053） U/mL，而Gen处理组PKA的活性为（0.97±0.09） U/mL，两组间差异显着，有计算学含义（P<0.01），如图2。
3 评论
Gen是一种来源于大豆以及其他豆科植物中的大豆异黄酮，其具有雌激素、抗氧化、调血脂等功能。流行病学查询标明，在常常食用豆制品的日本乳腺癌发病率仅为美国的1/4[4]，Gen可以下降乳腺癌[1]、前列腺癌[2]等激素依靠型肿瘤的发生率。有研讨[3，5]亦发现，Gen可以按捺子宫内膜腺癌细胞（JEC）、人肝癌SMMC-7721、人胃癌SGC-7901细胞的增殖有显着的按捺效果，但是Gen抗肿瘤效果分子机制尚不非常清楚[3]。本文研讨发现，与空白对照组相比较，光镜下经Gen处理的MGC-803细胞折光性差，细胞空隙增大，提示Gen对体外培育的MGC-803细胞具有细胞毒效果；而MTT试验成果验证Gen可以显着地按捺MGC-803细胞增殖，并跟着效果时刻和浓度的添加而增强，呈时刻及浓度依靠性。
cAMP-PKA信号通路介导一系列的神经递质、激素等胞外信号进入细胞内，激活此通路可按捺细胞增殖，诱导分解[4-10]。PKA通过磷酸化激活下流转录因子，调理靶基因的转录。如PKA可催化CREB（cAMP-responsive element binding Protein，CREB）、CREM（cAMP-responsive element binding modulator，CREM）及ATF1（activating transcription factor 1，ATF1）磷酸化，被激活的转录因子与CBP（CREB binding protein）和p300结合调控下流靶基因[8，11]。试验研讨已发现Gen可以激活SHZ-88大鼠乳腺癌细胞内cAMP-PKA信号通路，经浓度为15μg/mL的Gen处理5min和10min后，肿瘤细胞内cAMP浓度升高了11.0%和40.3%[9]。本文研讨显现，浓度为40μg/mL的Gen效果MGC-803细胞48h后，可以显着进步MGC-803细胞的PKA活性。试验成果提示Gen亦可以不通过第二信使cAMP而直接激活PKA，进而按捺体外培育的MGC-803细胞增殖。综上所述，Gen可以按捺体外培育的人胃癌MGC-803细胞系的增殖，上调PKA活性可能是Gen按捺MGC-803细胞增殖机制之一。
[参考文献]
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（收稿日期：2014-05-05）
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