血清血管严重素偏高 黄芪含药血清对血管严重素Ⅱ诱导内皮细胞排泄PAI—1的影响
邱宇安等
[摘要] 意图 评论血管严重素Ⅱ（AngⅡ）对内皮细胞（HUVECs）排泄1型纤溶酶原激活物按捺剂（PAI-1）的影响及黄芪含药血清对AngⅡ此效应的干涉效果。 办法 培育脐静脉内皮细胞株，对照组与AngⅡ干涉组：内皮细胞与不同浓度AngⅡ共孵育18 h；黄芪含药血清组：内皮细胞在不同浓度黄芪药血清培育基中培育24 h后，参加AngⅡ（×10-4 mol/L）培育18 h，酶联免疫吸附法（ELISA）测定PAI-1浓度。 成果 与对照组比较，不同浓度的AngⅡ均能影响HUVECs排泄PAI-1；黄芪含药血清可按捺AngⅡ促HUVECs排泄PAI-1的效应。 定论 黄芪含药血清或许经过按捺AngⅡ诱导的HUVECs排泄PAI-1效应，发作抗动脉粥样硬化的效果。
[关键词] 黄芪；血管严重素Ⅱ；内皮细胞；1型纤溶酶原激活物按捺剂
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）08（a）-0012-03
血管严重素Ⅱ（AngⅡ）是由血管严重素Ⅰ在血管严重素转化酶的效果下，水解发作的多肽物质，能发作多种生理效应，促进动脉粥样硬化（AS）的发作、开展，其间包含影响凝血和纤溶系统的活性平衡，促进血栓构成[1-3]。黄芪的药用前史悠久，临床上黄芪注射液已用于医治冠心病、糖尿病肾病等疾病[4-5]。本试验研讨AngⅡ对内皮细胞排泄1型纤溶酶原激活物按捺剂（PAI-1）的诱导效果及黄芪含药血清的干涉效应，评论黄芪含药血清的血管维护机制。
1 材料与办法
1.1 仪器与材料
胎牛血清（美国Gibco公司）；RPMI-1640培育基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Gibco公司）；黄芪（江西省中医院中药房）；AngⅡ（美国Sigma公司）；脐静脉内皮细胞株ECV-304（我国科学院上海细胞生物研讨所）；Wistar大鼠（南昌大学试验动物科学部）；PAI-1ELISA试剂盒（上海太阳生物技能公司）；酶标仪（芬兰Thermo bioanalysis公司）；超净工作台（姑苏安泰空气技能有限公司）。
1.2 不同剂量黄芪含药血清的制备
黄芪用清水冲刷，浸泡2 h后，武火煎至水沸，改用文火持续煎煮20 min，共煎3次，兼并3次煎液，3000 r/min离心10 min，取上清液，60℃水浴，浓缩至含生药1 g/ml[6]。20只Wistar大鼠随机分4组（对照组，小剂量黄芪组，中剂量黄芪组，大剂量黄芪组）。以黄芪成人临床日用量的大鼠等效剂量之1、2、4倍别离界说小、中、大剂量组。大鼠灌药液4 ml/d，对照组予等量生理盐水灌胃。接连给药1周，2次/d，于末次给药后2 h从心脏取血，选用一次性非抗凝真空采血管搜集全血，无菌操作。4℃静置2 h，上低温离心机，3500 rpm/min，离心15 min，别离血清，别离的血清同组混合，经56℃恒温灭活补体30 min处理后，超净台上用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。
1.3 试验进程
ECV304在37℃、5%CO2条件下培育于含10%胎牛血清的RPMI-1640培育基中，以0.25%胰酶、0.02%EDTA消化、传代。接种于细胞培育板，孵育至亚交融状况，进行分组及试验。
AngⅡ干涉试验。①空白对照组：未用AngⅡ，进行正常培育；②不同浓度AngⅡ干涉组：内皮细胞与不同浓度AngⅡ（10-6、10-5、10-4 mol/L）共孵育18 h。选用酶联免疫吸附法（ELISA）测定各组培育上清液中PAI-1的含量。
黄芪含药血清干涉试验。①空白对照组：培育液中不加诱导物，正常培育细胞。②阴性对照组：细胞在对照组大鼠血清培育液中培育。③黄芪含药血清干涉组：细胞别离在小、中、大剂量组大鼠血清培育液中培育。以上各组细胞培育24 h后，参加AngⅡ（10-4 mol/L）培育液培育18 h。
选用ELISA测定各试验组上清液中PAI-1的含量。每组设6个复孔，操作严厉按检测试剂盒阐明书进行。
1.4 计算学处理
选用SPSS 12.0计算软件对数据进行剖析，计量材料以x±s标明，选用方差剖析及q查验。以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 AngⅡ对内皮细胞排泄PAI-1的影响
与空白对照组比较，不同浓度的AngⅡ均可促进内皮细胞排泄PAI-1，差异有计算学含义（P<0.01）；不同AngⅡ浓度组之间比较，跟着AngⅡ浓度添加，促进效果无显着性差异（表1）。
2.2 黄芪含药血清的干涉效应
与空白对照组比较，阴性对照组不显着影响上清液中PAI-1的含量；用不同浓度的黄芪含药血清干涉后，PAI-1含量显着下降，差异有计算学含义（P<0.05），提示黄芪含药血清有按捺AngⅡ促内皮细胞排泄PAI-1的效果（表2）。
3 评论
血管内皮细胞不仅是全身血管内膜的屏障结构，并且具有多方面的生理功用，可保持凝血和纤溶系统的活性平衡[7-8]。内皮细胞结构和功用的危害是AS发病进程中重要的环节。
纤溶系统的活性首要取决于安排型纤溶酶原激活物（tPA）及其按捺物PAI-1之间的平衡，两者首要由血管内皮细胞发作，是动脉粥样硬化性疾病的独立猜测因子[9]。PAI-1可阻挠tPA激活纤溶酶原，促进血栓构成。PAI-1的浓度升高会显着促进AS的发展[10]。研讨标明，瘦素可经过上调内皮细胞PAI-1的排泄，发作对心血管系统的影响[11]。本试验证明，AngⅡ可诱导内皮细胞排泄PAI-1，与Brown等[12]研讨成果相一致，阐明AngⅡ或许经过诱导内皮细胞排泄PAI-1改动凝血和纤溶系统的活性平衡，然后发作促进AS的的效应。
在我国，黄芪有2000多年的药用前史，东汉张仲景所著《金匮要略》上即记载有多个含黄芪的丹方。传统医学以为，黄芪具有补中益气、利水消肿之成效[13]。现代体外试验证明，黄芪注射液可经过加强对氧自由基的铲除，保持血管内皮的正常功用[14]。动物体内试验证明，黄芪具有抗动脉粥样硬化的效果[15]。临床试验证明，黄芪可减轻心肌钙超载损害，改进心脏功用[16]。
本试验旨在调查黄芪对体外血管内皮细胞排泄PAI-1的影响，以进一步阐明黄芪维护血管内皮的机制。若用中药粗制剂直接参加体外的细胞培育反响系统中，中药自身杂乱的理化性质与杂质成分等会对细胞的成长形成必定的影响，影响试验成果。因而本试验将中药粗制剂给大鼠灌服后，用含有药物成分的血清替代中药粗制剂进行体外试验，扫除上述各种影响要素的搅扰，更挨近药物在体内环境中发作药理效应的实在进程[17-18]，提高了试验成果的可信度。
本试验证明黄芪含药血清能按捺由AngⅡ所诱导的内皮细胞排泄PAI-1，阐明黄芪含药血清可改进内皮纤溶活性，有助于动脉粥样硬化血栓性疾病的防治。但其详细效果成分及分子生物学机制，有待于进一步深入研讨。
[参考文献]
[1] Schmidt-Ott KM，Kagiyama S，Phillips MI.The multiple actions of angiotensin in atherosclerosis[J].Regul Pept，2000， 93（1-3）：65-77.
[2] Takayanagi T，Eguchi A，Takaguri A，et al.A repressor protein，Mnt，is a novel negative regulator of vascular smooth muscle cell hypertrophy by angiotensin Ⅱ and neointimal hyperplasia by arterial injury[J].Atherosclerosis，2013，228（1）：90-93.
[3] Wang Y，Tikellis C，Thomas MC，et al.Angiotensin converting enzyme 2 and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2013， 226（1）：3-8.
[4] 王光浩，张敬芳，张学福，等.黄芪注射液对冠心病患者胰岛素、血糖和血脂水平的影响[J].我国动脉硬化杂志，2010，19（3）：263.
[5] 郑坤.氯沙坦钾联合黄芪注射液医治前期糖尿病肾病的临床剖析[J].重庆医学，2013，42（11）：1231-1232.
[6] 杨庆有，冼绍祥，孙慧茹，等.黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的试验研讨[J].辽宁中医杂志，2008，35（6）：832-834.
[7] Kluge MA，Fetterman JL，Vita JA.Mitochondria and endothelial function[J].Circ Res，2013，112（8）：1171-1188.
[8] Ntaios G，Gatselis NK，Makaritsis K，et al.Adipokines as mediators of endothelial function and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2013，227（2）：216-221.
[9] Lijnen HR，Collen D.Impaired fibrinolysis and the risk for coronary heart disease[J].Circulation，1996，94（9）：2052-2054.
[10] Brown NJ，Kim KS，Chen YQ，et al.Synergistic effect of adrenal steroids and angiotensin Ⅱ on plasminogen activator inhibitor-1 production[J].J Clin Endocrinol Metab，2000，85（1）：336-344.
[11] Ploplis VA.Effects of altered plasminogen activator inhibitor-1 expression on cardiovascular disease[J].Curr Drug Targets，2011，12（12）：1782-1789.
[12] Singh P，Peterson TE，Barber KR，et al.Leptin upregulates the expression of plasminogen activator inhibitor-1 in human vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，392（1）：47-52.
[13] 闫凌云.黄芪多糖对糖尿病肾病防治机制的研讨发展[J].医学总述，2012，18（11）：1727-1729.
[14] 李绚，阎蓉华，罗照田，等.黄芪注射液对人脐静脉血管内皮细胞的增殖效果[J].华西药学杂志，2005，20（1）：48.
[15] 张俊峰，高振华，张桂英，等.黄芪、三七有效成分配伍抗动脉粥样硬化效果的试验研讨[J].中西医结合心脑血管病杂志，2009，7（2）：188-189.
[16] 杨庆有，陆曙，孙慧茹.黄芪对缓慢心力衰竭患者心功用与血清肿瘤坏死因子水平的影响[J].我国中西医结合杂志，2010，30（7）：699-701.
[17] 王洪武，倪青，林兰.中药含药血清的研讨发展及其在中医学中的使用[J].北京中医药，2008，27（9）：698-701.
[18] 孙莉娜，孟静岩，孙晓霞.中药血清药理学办法相关问题的考虑[J].西部中医药，2012，25（11）：36-38.
（收稿日期：2015-03-16 本文修改：王红双）