压力性尿失禁怎样医治：压力性尿失禁大鼠模型阴道前壁安排中结缔安排生长因子和整合素β1的表达
崔灿 王志莲 郝敏等
[摘要] 意图 评论结缔安排生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）及整合素β1（integrin β1）在压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）大鼠模型阴道前壁中的表达。 办法 将健康雌性SD大鼠24只随机分为3组，A组大鼠作为对照组不做任何处理；B组大鼠仅行阴道扩张；C组大鼠行阴道扩张加双侧卵巢切除。于术后第4周测定最大膀胱容量（MBC）和腹压漏尿点压（ALPP），检测压力性尿失禁模型是否树立成功。建模成功4周后处死大鼠后取阴道前壁安排，行免疫组化染色办法和实时荧光定量TR-PCR技能检测CTGF和整合素β1的表达。成果 尿流动力学检测（MBC、ALPP）：B、C组较A组显着下降，且各组之间比较均有统计学含义（P<0.05）；CTGF mRNA与蛋白质的表达C组低于A组（P<0.05），A、B两组之间比较差异无统计学含义（P>0.05）；C组整合素β1 mRNA及蛋白质的表达显着低于A、B组（P<0.05），且A、B两组之间比较差异有统计学含义（P<0.05）。 定论 在SUI大鼠阴道前壁CTGF和整合素β1的低表达可能与压力性尿失禁等盆底支撑结构的退行性病变的发作存在密切联系。
[关键词] 压力性尿失禁；结缔安排生长因子；整合素β1
[中图分类号] R694.54 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）11-0025-04
[Abstract] Objective To investigate the expression of the connective tissue growth factor（CTGF） and integrin β1 in vaginal anterior wall of the model rats with stress urinary incontinence. Methods Twenty-four healthy female SD rats were randomly divided into three groups， group A rats as control group without any treatment；group B rats only with vaginal expansion；group C rats with vaginal expansion and bilateral ovaries removed. At postoperative four weeks to determine the maximum bladder capacity （MBC） and abdominal pressure leakage point pressure （ALPP）， to establish detection model for stress urinary incontinence. Modeling successfully executed in rats after four weeks after vaginal anterior wall tissue， immunohistochemical staining method and real-time fluorescent quantitative RT-PCR technique to detect the expression of CTGF and integrin β1. Results The urine flow dynamic detection （MBC， ALPP）： B and C group was significantly lower than group A， there were statistically significant differences（P<0.05）；CTGF mRNA and protein expression in group C was significantly lower than group A （P<0.05）， there were no statistical significance between group A and group B（P>0.05）；integrin β1 mRNA and protein in group C expression was lower than that in group A and B（P<0.05）， and differences between A and B were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The anterior wall vaginal CTGF in rats in SUI and low expression of integrin β1 may be related to stress urinary incontinence and other pelvic floor support structure there is a close relationship of the occurrence of degenerative diseases of the pelvic floor support degenerative diseases.
[Key words] Stress urinary incontinence； Connectivetissue growth factor； Integrin β1
压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI） 界说为在无逼尿肌缩短的情况下，腹压增高引起膀胱内压增高，超越尿道和括约肌发作的压力，尿液自尿道外口漏出的现象[1]。要挟生命且严峻影响到患者的心思、生理健康，一起会给社会构成必定程度的经济负担。盆底结缔安排结构改动或功用削弱的分子学机制是现在压力性尿失禁研讨的热门[2]。近些年来关于SUI发病机制的研讨越来越受到重视，研讨标明[3]，在SUI患者盆底支撑结构中，胶原弹性蛋白含量的削减会导致支撑安排弹性削弱，然后呈现盆底的松懈，进一步导致SUI。而结缔安排生长因子（connectivetissue growth factor，CTGF）能够影响成纤维细胞增殖和排泄胶原，在纤维化性疾病伤口后瘢痕构成等方面有较多的研讨，含β1亚单位的整合素首要介导细胞与细胞外基质成分之间的黏附，近年研讨发现CTGF能够经过与整合素受体结合调理细胞内信号通路的活性。可是关于整合素β1在SUI发作开展机制的相关研讨较为罕见。本试验的研讨意图为检测CTGF和整合素β1在压力性尿失禁大鼠模型的阴道前壁中的表达，进一步探究其在压力性尿失禁发作机制中的效果，以期为压力性尿失禁的防备、医治供给试验根底及理论依据。
1材料与办法
1.1 试验动物
24只健康雌性SD大鼠由山西医科大学生理试验室供给，体重220～250 g。随机分三组，每组8只：A组不做任何处理；B组行阴道扩张模仿难产；C组模仿难产加双侧卵巢切除。4周后经检测建模是否成功（尿动力学检测和喷嚏试验证明 ），见表1。
1.2 标本收集及处理
造模成功后惯例喂食4周后将大鼠处死，取阴道前壁安排两块，约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，重复、屡次用生理盐水洗净，一块放入加有中性缓冲液的10%的甲醛液中固定，预备行免疫安排化学检测。另一块当即放入-80℃液氮中，以防止mRNA降解，待行实时荧光定量TR-PCR技能检测。
1.3 试剂
羊抗兔CTGF、整合素β1和β-actin多克隆抗体（博奥森生物技能有限公司），辣根过氧化酶的山羊抗鼠二抗（购于北京中杉金桥公司），试剂盒、RT-PCR盒及相关试剂（北京全式金生技能有限公司），引物（北京广博泰克生物技能公司）。
1.4 免疫安排化学检测CTGF及整合素β1蛋白的表达
选用SABC法进行免疫安排细胞化学染色。成果断定：细胞外基质染为黄色或棕黄色为CTGF蛋白及β1整合素蛋白阳性。操作过程按免疫细胞化学检测试剂盒说明书进行。用BI 2000医学图画剖析体系收集显微镜下图画，随机在每张免疫组化切片上挑选5个视界 （400倍），每个视界拍照5张相片，依据阳性细胞个数（A）及细胞显色程度（B）核算免疫组化评分（IHS），以其均值进行比较[4]。
1.5 实时荧光定量TR-PCR
依照Trizol试剂运用说明书提取总RNA，经AMV逆转录组成cDNA。引物碱基序列见表2。反响条件为：94℃预变性5 min，94℃预变性2 min，35个循环（94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min），72℃终究延伸5 min。依据实时荧光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表达为内对照，首要核算出各意图基因的CT值与β-actin内参基因的CT值的差值，即ΔCT=CT（意图基因）-CT（β-actin），然后核算试验组各样本的ΔCT值与对照组样本的ΔCT值的差值，然后得到ΔΔCT值，即ΔΔCT=ΔCT（试验组）-CT（对照组），使用2-ΔΔCT进行核算，标明试验组测定基因的表达相关于对照组样本基因的表达的改变倍数[5]，将2-ΔΔCTx±s作为终究的定量成果用于统计剖析。
1.6 统计学办法
选用SPSS 13.0软件进行统计剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，多组间正态分布选用单要素方差剖析，两两之间比较选用LSD-t法；不满足正态性和方差齐性则选用秩和查验。P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 免疫组化检测CTGF、整合素β1蛋白的表达
见图1、2及表3。镜下3组阴道前壁标本均可见CTGF蛋白及整合素β1蛋白表达于成纤维细胞胞浆。A组CTGF蛋白的等级材料免疫组化评分为（7.75±1.49）分，B组免疫组化评分为（6.25±1.91）分，C组免疫组化评分为（5.50±0.93）分，A组与B组比较差异无统计学含义（P>0.05），A组显着高于C组，差异有统计学含义（P<0.05），B组与C组比较差异无统计学含义（P>0.05）；A、B、C三组整合素β1蛋白的免疫组化评分分别为（6.13±1.36）分、（5.00±1.07）分、（3.63±0.74）分，A组与B组比较差异无统计学含义（P>0.05），C组显着低于A、B两组，差异有统计学含义（P<0.05）。
2.2 RT-PCR检测CTGF mRNA及整合素β1 mRNA的表达
见表4。B组、C组CTGF mRNA的表达量均低于A组，差异有统计学含义（P<0.05），但B组与C组比较差异无统计学含义（P>0.05）；C组整合素β1 mRNA的相对表达量低于A组、B组，差异有统计学含义（P<0.05），但B组与A组比较差异无统计学含义（P>0.05）。
3评论
压力性尿失禁有“交际癌”之称，严峻地影响了女人的交际活动，一起还可引发心思障碍，给家庭和国家医疗效劳添加必定的经济负担[5]。因为临产、手术等原因所构成得盆底安排损害与女人SUI有直接的联系。
随后Batmunkh等[6]在PDGF诱导下的人类脐静脉内皮细胞培育基中发现CTGF的排泄，并将其初次克隆出来。CTGF也称作CCN2，归于立刻前期基因（CCN）宗族的成员之一[7]，其编码基因定坐落6号染色体长臂（6q23.1）上，是一种由349个氨基酸残基组成的富含半胱氨酸的排泄性多肽[8]，分子量为36～38 kD[9]。CTGF的来历细胞品种繁复，如胚胎细胞、肾间质细胞、肾小球系膜细胞、肝星状细胞、血管内皮细胞及滑润肌细胞等。CTGF在人类心脏、胎盘、肺、肝脏及肾脏等多种安排器官中均有表达。在安排损害修正、纤维化、溃疡愈合及肿瘤发作等多种安排重建相关性疾病中，CTGF均起到重要效果[10，11]。Daniels等[12]研讨证明在成纤维母细胞中，少数表达的CTGF可促进胶原的缩短，操控基质金属蛋白酶MMPs的效果，据此估测CTGF在SUI的发作开展中可能与盆底安排损害后修正有关。现在使用脂肪源性干细胞（ADSC）增殖和分化为成纤维细胞来医治SUI，是盆底疾病范畴的一个研讨热门[13，14]。有研讨标明，在体外培育的大鼠脂肪干细胞中发现CTGF影响能够使各型胶原表达逐步添加，而且跟着影响时刻的延伸而逐步上升[15]。本试验成果显现，在压力性尿失禁大鼠模型阴道前壁安排中，阴道扩张加双侧卵巢切除组的CTGF蛋白和mRNA表达水均匀显着低于正常组，但阴道扩张组及阴道扩张加双侧卵巢切除组CTGF的蛋白和mRNA水平的比较无显着差异，提示在CTGF表达下降，可能削减影响成纤维细胞的增殖和胶原的排泄，然后影响盆底结缔安排结构的稳定性及完整性，可能是导致SUI发作的重要原因。
整合素β1是一类近年来新发现的CTGF的细胞外表受体，CTGF能够直接与其细胞外表的整合素β1受体结合进而发动下流细胞信号转导途径，发挥促进纤维化的效果。有研讨报导，在肝纤维化发作开展中，整合素β1发挥了调理细胞增殖、黏附等功用。现在国内外首要在心、肝及皮肤瘢痕等安排中对整合素β1进行研讨，其过度表达能够导致一些纤维化性或增生性的疾病发作，如肝硬化、肝纤维化等。可是现在在SUI方面的研讨较罕见。本试验成果显现，在压力性尿失禁大鼠模型阴道前壁安排中，阴道扩张加双侧卵巢切除组的整合素β1蛋白和mRNA表达水均匀显着低于正常组及仅阴道扩张组，提示在SUI的发作机制中，整合素β1表达的下降可能影响其作为受体与CTGF结合，将信号传递至细胞内，进一步导致盆底结缔安排损害后的修正。
综上所述，多种要素归纳效果下导致盆底结缔安排中胶原含量的削减及其效果的发挥，终究可能构成SUI的发作。CTGF/整合素β1信号转导通路与SUI的发作机制的相关性研讨，现在还在动物安排学水平的试验阶段，依据现有试验定论估测，有效地按捺该通路，可能会引起成纤维排泄胶原蛋白的削减，而导致SUI的发作。如果能以此通路的效果机制作为往后SUI发作的研讨靶点，进一步研讨二者下流发动哪些信号通路来发挥效果，可能为SUI的防备、医治供给必定的理论依据。
[参考文献]
[1] Hunskaar S，Burgio K，Clark A，et al. Epedemiology of urinary andfecal incontinence and pelvic organ prolapsed[M]//Abrams P，Cardozo L，Khoury S，et al. Incontinence：3rd international consultation on incont inence[M]. Paris：Health Publication Ltd，2005：255-312.
[2] Koike Y，Furuta A，Suzuki Y，et al. Pathophysiology of urinary incontinence in murine models[J]. Int J Urol，2013，20（1）： 64-71.
[3] 曹冬，王建六. 盆底结缔安排胶原代谢反常与压力性尿失禁[J]. 国外医学（妇产科学分册），2006，33（2）：89-91.
[4] Soslow RA，Dannenberg AJ，Rush D，et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary，colonic，and mammary tumors[J]. Cancer，2000，89：2637-2645.
[5] 朱兰，郎景和，刘春燕，等. 我国成年女人尿失禁患病情况的流行病学研讨[J]. 中华妇产科杂志，2009，44（10）：776-779.
[6] Batmunkh R，Nishioka Y，Aono Y，et al. CCN6 as a profibrotic mediator that stimulates the proliferation of lung fibroblasts via the integrin beta1/focal adhesion kinase pathway[J]. The journal of medical investigation， 2011，58（3-4）：188-196.
[7] Katsube K，Sakamoto K，Tamamura Y，et al. Role of CCN， a vertebrate specific gene family，indevelopment[J]. Dev Growth Differ，2009，51（1）：55-67.
[8] Riser BL，Najmabadi F，Perbal B，et al. CCN3 （NOV） is a negative regulator of CCN2（CTGF）and a novel endogenous inhibitor of the fibrotic pathway in an in vitro model of renal disease[J]. Am J Pathol，2009，174（5）：1725-1734.
[9] Hao S，Shen H，Hou Y，et al. tPA is a potent mitogen for renal interstitial fibroblasts：Role of beta1 integrin/focal adhesion kinase signaling[J]. The American Journal of Pathology， 2010，177（3）：1164-1175.
[10] An J，Zheng L，Xie S，et al. Down-regulation of focal adhesion kinase by short hairpin RNA increased apoptosis of rat hepatic stellate cells[J]. Acta Pathologica， Microbiologica，Etimmunologica Scandinavica，2011，119（6）：319-329.
[11] Liu Z，Zhou Y，Wu W. Effect of antisense oligonucleotides targeting focal adhesion kinase on the proliferation and activation of hepatic stellate cells[J]. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi，2008，25（2）：419-423.
[12] Daniels JT，Schultz GS，Blalock TD，et al. Mediation of transforming growth factor-beta（1）-stimulated matrix contraction by fibroblasts：A role for connective tissue growth factor in contractile scarring[J]. Am J Pathol，2003，163（5）：2043-2052.
[13] Nikolavasky D，Stangel-Wójcikiewicz K，Stec M，et al. Stem cell therapy：A future treatment of stress urinary incontinence[J]. Semin Reprod Med，2011，29（1）：61-70.
[14] Stangel-Wójcikiewicz K，Majka M，Basta A，et al. Adult stem cells therapy for urine incontinence in women[J]. Ginekol Pol，2010，81（5）：378-381.
[15] Hwang JH，Kim IG，Piao S，et al. Combination therapy of human adipose-derived stem cells and basic fibroblastgrowth factor hydrogel in muscle regeneration[J]. Biomaterials，2013，34（25）：6037-6045.
（收稿日期：2015-01-28）